Princip. Brojanje leukocita tijekom mikroskopije na određenom broju kvadrata brojačke komore i izračunavanje njihovog broja u 1 litri krvi, uzimajući u obzir razrjeđivanje krvi i volumen komore za brojanje.
Reagens: 3-5% otopina octene kiseline, obojena za bojenje jezgre leukocita s nekoliko kapi otopine metilenskog plavog. Otopina ima plavu boju, može se pohraniti dugo vremena.
Tijek određivanja. U suhu epruvetu uliti 0,4 ml otopine octene kiseline. Od prsta se prikupi 0,02 ml krvi (možete koristiti vensku krv stabiliziranu antikoagulansom). Obrišite vrh pipete, zatim ispuhajte krv iz nje na dno epruvete, promiješajte, ponovno birajte i otpuhajte mješavinu krvi i reagensa (pipetiranje). Označite epruvetu i ostavite je do prebrojavanja. Store mješavinu krvi s otopinom octene kiseline se preporučuje ne više od 2-4 sata.
Krva razrijeđena u epruveti s octenom kiselinom, dobro promiješajte i napunite komorom za brojanje. Napunjena komora ostavljena je u vodoravnom položaju 1 min da bi se taložile bijele krvne stanice. Bez promjene vodoravnog položaja fotoaparata, postavljaju ga na stol mikroskopa i pri malom uvećanju (okular 10 ×, objektiv 8 ×) prebrojavaju bijele krvne stanice u 100 velikih kvadrata, što odgovara 1600 malih.
Za veću točnost, leukociti se broje preko mreže na velikim kvadratima, ne dijele se na male kvadrate i pruge, počevši od gornjeg lijevog kuta rešetke. Za bolji kontrast zamračite vidno polje, spustite kondenzator i zatvorite otvor. Stanice koje se nalaze unutar kvadrata i leže na bilo koje dvije linije broje se kako ne bi dvaput brojale istu ćeliju.
Izračun broja leukocita provodi se prema formuli:
gdje je X broj leukocita u 1 μl krvi; i - broj leukocita u 100 velikih kvadrata; 20 - razrjeđenje krvi; 100 je broj velikih kvadrata; 250 je faktor konverzije po 1 μl, budući da je volumen jednog velikog kvadrata 1/250 μl (strana kvadrata je 1/5 mm, visina 1/10 mm).
U praksi, da bi se izračunao broj leukocita u 1 μl krvi, njihov broj u 100 velikih kvadrata pomnoži se s 50, au 1 litru - dobivena vrijednost množi se s 106.
Napomena. Kod brojanja leukocita, pogreška je neizbježna u 6-8% slučajeva.
- Kod velikog broja normocita u perifernoj krvi oni se broje u broju leukocita (i leukocita i normocita - stanica jezgre). Kako bi se pravilno utvrdio broj leukocita, od ukupnog broja nukleiranih krvnih stanica treba oduzeti broj normocita.
- Preostale pogreške su slične onima koje se pojavljuju pri izračunavanju broja crvenih krvnih zrnaca u komori za brojanje.
Broj leukocita
Za prikupljanje krvi u mješalici leukocita do oznake 0,5. Odmah dodati krvi u otopinu za razrjeđivanje od 3% octene kiseline kako bi se označilo 11. Temeljito promiješati sadržaj kapilare i njime ponovno napuniti Goryaevovu komoru. Brojanje se provodi na najmanje 100 velikih kvadrata. To su velike neoznačene crte, koje su grupirane u četiri u rešetki Goryavove kamere. Izračunajte broj leukocita u 1 l krvi pomoću formule:
L = N x 4000 x 20 x 10 6
gdje: N je broj leukocita u stotinu velikih kvadrata; 4000 je množitelj koji smanjuje volumen malog kvadrata na volumen od 1 μl krvi; - korekcija za stupanj razrjeđenja krvi; 1600 - broj leukocita u malim kvadratima; 10 6 - broj mikrolita u 1 l.
Preporuke za registraciju
U zaključku usporedite dobivene rezultate s normalnim vrijednostima.
Lab № 7.3
Određivanje količine hemoglobina u krvi
194.48.155.245 © studopedia.ru nije autor objavljenih materijala. No, pruža mogućnost besplatnog korištenja. Postoji li kršenje autorskih prava? Pišite nam | Kontaktirajte nas.
Onemogući oglasni blok!
i osvježite stranicu (F5)
vrlo je potrebno
Brojanje bijelih krvnih stanica
Leukocitoza može biti apsolutna (istinita) i relativna (redistributivna).
Apsolutna leukocitoza uočena je kod akutnih upalnih procesa, nekroze tkiva, akutnih bakterijskih infekcija (s iznimkom tifusne groznice, bruceloze, tularemije, itd.), Alergijskih stanja, malignih tumora (s uništavanjem tkiva), zatvorenih ozljeda glave i krvarenja u mozgu, dijabetesa. uremička koma, šok, akutni gubitak krvi, kao primarna reakcija - zračenjem. Kod leukemije dolazi do značajnog povećanja broja leukocita.
Relativna (redistributivna) posljedica je primitka leukocita u protoku krvi iz organa koji služe za njezin depo. Pojavljuje se nakon jela (leukocitoza hrane), toplih i hladnih kupki, jakih emocija (vegetovaskularna leukocitoza), intenzivnog mišićnog rada (miogene leukocitoze), itd.
Leukopenija. Leukopenija se smatra pokazateljem inhibicije funkcionalne sposobnosti koštane srži kao posljedice izloženosti toksičnim tvarima (arsen, benzen, itd.), Nekim lijekovima (sulfanilamidi, kloramfenikol, butadion, imuno, ciklofosfamid itd.), Virusi (gripa, virusni hepatitis)., ospice, itd.), mikrobe (tifus, bruceloza, itd.), ionizirajuće zračenje, rendgenske zrake i hipersplenizam (povećana funkcija slezene).
Leukocitoza i leukopenija rijetko su karakterizirane proporcionalnim povećanjem (smanjenjem) ukupnog broja leukocita svih vrsta (na primjer, leukocitoza s zgušnjavanjem krvi); u većini slučajeva dolazi do povećanja (smanjenja) broja bilo koje vrste stanica, stoga se koriste pojmovi "neutrofilija", "neutropenija", "limfocitoza", "limfopenija", "eozinofilija", "eozinopija", "monocitoza", "monocitopenija"., "Bazofilija."
U kliničkoj procjeni promjena broja leukocita veliku važnost pridaje postotnom omjeru pojedinih oblika leukocita, tj. Leukocitne formule.
Leukocitna krvna slika zdrave osobe:
Relativni iznos Apsolutni iznos
Bazofili ……………………….0-1% 0-0.0650 x 10 9 / l
Eozinofili …………………….0.5-5% 0.02-0.30 x 10 9 / l
Neutrofili: - mielociti... 0% odsutni
- izboden... 1-6% 0,040-0,300 x 109 / l
- segmentirano….47-72% 2,0-5,5 x 10 9 / l
Limfociti …………………………….19-37% 1,2-3,0 x 10 9 / L
Monociti ………………………….3-11% 0,09-0,6 x 10 9 / L
Brojanje leukocita provodi se u obojenim razmazima periferne krvi. Za ispravno tumačenje rezultata proučavanja formule leukocita preporučuje se računati u apsolutnim količinama, ali ne u relativnim. Najčešće metode slikanja razmaza Romanovskog-Giemsa, Pappenheim. Pod imerzijom se broji najmanje 200 stanica, a zatim se dobije postotni omjer određenih tipova leukocita. Analiza leukograma uzimajući u obzir druge krvne parametre i kliničku sliku vrijedna je metoda ispitivanja, pomaže u dijagnozi i određivanju prognoze bolesti.
Glavni uzroci neutrofilije.
Akutne bakterijske infekcije - lokalizirane i generalizirane.
Upala ili nekroza tkiva.
Ljekoviti učinci (kortikosteroidi).
Glavni uzroci neutropenije.
Infekcije - bakterijske (tifus, bruceloza, tularemija, paratifus) i virusne (infektivni hepatitis, ospice, gripa, rubeola i dr.).
Mijelotoksični učinci i supresija granulocitopoeze (ionizirajuće zračenje; kemijska sredstva - benzen, anilin, DDT; ljekoviti učinci - citostatici i imunosupresivi; vitamin-B12-nedostatak folne kiseline, akutna aleukemijska leukemija, aplastična anemija).
Izloženost antitijelima (imuni oblici) - preosjetljivost na lijekove, autoimune bolesti (SLE, reumatoidni artritis, kronična limfna leukemija), izoimune manifestacije (hemolitička bolest novorođenčeta).
Redistribucija i taloženje u organima - stanja šoka, bolesti sa splenomegalijom i hipersplenizmom.
Nasljedni oblici (obiteljska benigna kronična neutropenija).
Glavni uzroci eozinofilije.
Parazitske invazije (trihinoze).
Kronične lezije kože - psorijaza, pemfigus, ekcem.
Tumori (eozinofilne varijante leukemije).
Ostale bolesti - fibroplastični endokarditis Lefflera, grimizna groznica.
U fazi oporavka infekcija i upalnih bolesti (povoljan prognostički znak).
Uzroci eozinopenije (aneozinofilija).
Povećana aktivnost adrenokortikosteroida u tijelu.
Glavni uzroci bazofilije:
Kronična mijeloidna leukemija i eritremija.
Glavni uzroci monocitoze.
Subakutne i kronične bakterijske infekcije.
Parazitske infekcije - lišmanijaza, malarija.
Hemoblastoza - monocitna leukemija, limfogranulomatoza, limfomi.
Ostala stanja su SLE, sarkoidoza, reumatoidni artritis, infektivna monocitoza; u razdoblju oporavka od infekcija, pri ostavljanju agranulocitoze, nakon splenektomije.
Smanjenje broja monocita je važno u procjeni omjera limfocita i monocita u plućnoj tuberkulozi.
Glavni uzroci limfocitoze.
Infekcije - akutni virusni (infektivna mononukleoza, ospice, rubeola, boginje), kronična bakterija (tuberkuloza, sifilis, bruceloza), protozoa (toksoplazmoza).
Hemoblastoza (limfocitna leukemija, limfom).
Ostale bolesti - hipertireoza, Addisonova bolest, vitamin B12-folna anemija, hipo-i aplastična anemija.
Limfocitopenija je uočena kod SLE, Hodgkinove bolesti, raširene tuberkuloze limfnih čvorova, u terminalnom stadiju zatajenja bubrega, akutne radijacijske bolesti, stanja imunodeficijencije, uzimanja glukokortikoida.
Povećanje ili smanjenje broja određenih vrsta leukocita u krvi može biti relativno ili apsolutno. Ako se mijenja samo postotak određene vrste bijelih krvnih stanica, tada dolazi do relativne neutrofilije, relativne eozinopenije itd. Povećanje ili smanjenje apsolutnog sadržaja bilo koje vrste leukocita, odnosno broj tih stanica po jedinici volumena krvi, naziva se apsolutna neutrofilija, apsolutna eozinopenija itd.
Pomicanje formule ulijevo (povećanje broja mladih oblika neutrofila) znak je upale ili nekrotičnog procesa u tijelu.
Pomak leukocitne formule u desno je karakteristika radijacijske bolesti i vitamina-B12-nedostatak folne kiseline.
Izostanak ili značajno smanjenje broja svih vrsta granularnih leukocita - granulocita (neutrofila, eozinofila, bazofila) označeno je izrazom agranulocitoza. Ovisno o mehanizmu pojave, razlikuju se mijelotoksični (učinci ionizirajućeg zračenja, citostatski unos) i imunološki (hapten i autoimune agranulocitoza).
Broj leukocita
Način brojanja u fotoaparatu. Uzimanje i razrjeđivanje krvi proizvedeno metodom cijevi. 0,4 ml tekućine za razrjeđivanje i 0,02 ml kapilarne krvi unose se u epruvetu (po mogućnosti Vidalevskaya). Dobiveno razrjeđenje praktički se smatra 1:20, a kao razrjeđivač se obično koristi 3-5% -tna otopina octene kiseline obojana metilenskim plavim (lizes octene kiseline, eritrociti, metilensko plavo, jezgre leukocita). Prije punjenja komore Goryaeva cijev s razrijeđenom krvi temeljito se protrese. Komora je napunjena na isti način kao i za brojanje crvenih krvnih stanica.
Leukociti su mnogo manji od eritrocita (1-2 na veliki kvadrat), stoga se za točnost računaju u 100 velikih kvadrata (negradirani). Izračun: 100 velikih kvadrata (1600 malih) se računa kao leukocit.
Podsjetivši da je volumen malog kvadrata 1/4000 mm3, a krv razrijeđena 20 puta, izračunat je broj leukocita u 1 μl krvi: 4000 20 i podijeljen sa 1600 = a x 1/2. Praktično, za dobivanje stvarnog sadržaja leukocita u 1 μl krvi, dovoljno je podijeliti na pola broj dobiven u izračunu i dodati 2 nule. Prosječna pogreška metode je ± 7%.
Točnije (pogreška od 2-3%) i savršena je broj leukocita pomoću elektroničkih uređaja. Brojanje leukocita u brojačima čestica provodi se prema istom principu kao i eritrociti. Prijekrv se razrijedi i pomiješa s bilo kojim reagensom koji lizira crvene krvne stanice. U autoanalizatoru "Technicon", kao takva se koristi otopina octene kiseline, u uređajima "Culter" i "Celloskop" - saponin ili sapoglobin, koji se dodaju razrijeđeni (1: 500, 1: 700) u izotoničnoj otopini natrijevog klorida (6 kapi po 20 ml). razrjeđenje).
Brojanje leukocita u krvi provodi se u obojenim razmazima periferne krvi.
Bolje je brojati na najtanjem mjestu blizu kraja razmaza, najmanje 200 stanica (osim izražene leukopenije), a zatim izračunati postotni omjer određenih vrsta bijelih krvnih stanica. Brojanje se preporuča u istom redoslijedu: polovica stanica se broji na vrhu, pola na dnu poteza, bez odlaska na sam rub i sredinu, cik-cak (3-4 vidna polja uzduž udarca, 3-4 polja pod pravim kutom prema sredini udarca, zatim 3-4 polja u stranu paralelno s rubom, ponovno pod pravim kutom prema gore i tako dalje na jednu stranu).
Priprema razmaza. Pažljivo oprano i odmašćeno staklo (njegov rub) dodiruje kap krvi na mjestu ubrizgavanja. Razmažite brusnim staklom, stavljajući ga pod kutom od 45 ° na klizač ispred kapljice. Nakon što su doveli čašu do te kapi, oni čekaju da se krv širi duž njezinog ruba, a zatim jednostavnim pokretom izvrše brusno staklo naprijed, ne odvajajući ga od objekta prije nego što isuši cijelu kap.
Ispravno napravljen razmaz ima žućkastu boju (tanku), ne doseže rubove stakla i završava tragom (brkovima).
Bojenje suhih razmaza nakon prethodne fiksacije. Najbolja fiksacija se postiže u apsolutnom metilenskom alkoholu (3-5 minuta) ili u mješavini Nikiforova od jednakih dijelova apsolutnog etanola i etera (30 minuta).
Glavne hematološke boje uključuju metilensko plavo i njegov derivat - azurno I (metilen azurno) i azurno II (mješavina jednakih dijelova azurnog I i metilensko plavog), do kiselog - vodotopivi žuti eozin.
● Slikarstvo Romanovskog-Giemsa. Romanovsky-Giemsa boja (tvornički proizvedena) ima sljedeći sastav: Azur II - 3 g, vodotopivi žuti eozin - 0,8 g, metilni alkohol - 250 ml i glicerin - 250 ml. Radna otopina boje priprema se po stopi od 1,5-2 kapi gotove boje po 1 ml destilirane vode. Boja se izlije na razmaz s mogućim višim slojem; vrijeme bojanja - 30-35 minuta Nakon tog razdoblja obrisci su isprani vodom i osušeni na zraku. U ovoj metodi moguće je dobro razlikovati jezgru, ali je neutrofilna zrnatost citoplazme mnogo gora, pa se naširoko koristi za bojenje razmaza periferne krvi.
● Kombinirano bojanje May-Grunwald-Romanovsky-Giemsa prema Pappenheimu. Gotova boja, May-Grunwaldov fiksativ, otopina eozinmetilen plavog u metilenskom alkoholu, pipetira se na fiksni razmaz 3 minute. Nakon 3 minute, doda se jednaka količina destilirane vode u boju koja pokriva otopinu i obojenje se nastavi još 1 minutu. Nakon toga, boja se ispere i razmaz se suši na zraku. Zatim se osušeni razmaz preboji svježe pripremljenom vodenom otopinom Romanovskog boje 8-15 minuta. Ova metoda se smatra najboljom, posebno za mrlje punktova koštane srži.
Povećanje broja leukocita u perifernoj krvi iznad normalne razine naziva se leukocitoza, a smanjenje se naziva leukopenija. Leukocitoza (leukopenija) rijetko je obilježena proporcionalnim povećanjem (smanjenjem) broja leukocita svih vrsta, na primjer, leukocitoze s zgušnjavanjem krvi. U većini slučajeva dolazi do povećanja broja (smanjenja) bilo kojeg tipa stanica. Povećanje ili smanjenje broja pojedinačnih tipova leukocita u krvi može biti relativno ili apsolutno, ovisno o ukupnom broju leukocita - normalnom, povišenom ili smanjenom. Promjena broja, omjera pojedinih oblika i morfologije leukocita ovisi o vrsti i virulentnosti patogena, prirodi, tijeku i opsegu patološkog procesa, individualnoj reakciji organizma.
Leukociti (leukociti)
Leukociti. Kvantitativno određivanje leukocita. Brojanje leukocita pomoću kamere Goryaeva. Kvantitativni sadržaj leukocita. Leukocitoza.
Bijele krvne stanice
Broj leukocita u krvi ovisi kako o brzini njihovog stvaranja, tako io njihovoj mobilizaciji iz koštane srži, kao io njihovoj uporabi i migraciji u tkiva (na lezije), hvatanje plućima i slezenom. Ti procesi, pak, pod utjecajem su brojnih fizioloških čimbenika, pa je stoga broj leukocita u krvi zdrave osobe podložan fluktuacijama: ona raste do kraja dana, tijekom fizičkog napora, emocionalnog stresa, unosa proteinske hrane i naglih promjena temperature okoline.
Kvantitativno određivanje leukocita
Leukociti se broje pomoću kamere Goryaev i korištenjem automatskih brojača.
Brojanje leukocita pomoću kamere Goryaeva
S metodom in vitro uzimanja krvi za brojanje leukocita:
- U epruvetu se ulije 0,4 ml otopine 3-5% -tne octene kiseline obojene metilen-plavom. Pomoću kapilarne pipete izvucite 20 μl krvi iz svježe kapi (razrjeđenje 20 puta), pažljivo je propušite u epruvetu s reagensom i isperite pipetu. Dobro izmiješati;
- čisto i suho pokrovno staklo se protrlja na komoru tako da se na mjestu kontakta formiraju duginih prstena;
- razrijeđena krv u epruveti, dobro promiješajte. Kraj okrugle staklene šipke uzima kap krvi i dovodi je do ruba poliranog stakla komore;
- nakon punjenja komore ostavlja se 1 minutu mirovanja za taloženje leukocita;
- Smatra se da su leukociti pri malom povećanju (objektiv × 8 ili × 9, okular × 10 ili × 15) s tamnim vidnim poljem (s spuštenim kondenzatorom ili suženom dijafragmom);
- za zadovoljavajuće rezultate, leukociti se broje u 100 velikih kvadrata.
Znajući volumen velikog kvadrata i stupanj razrjeđenja krvi, pronađite broj leukocita u 1 μl i 1 l krvi. Strana velikog kvadrata je 1/5 mm, površina je 1/25 mm2, a volumen prostora iznad tog kvadrata je 1/250 mm3.
Formula za brojanje bijelih krvnih stanica:
gdje je B broj leukocita u 100 velikih kvadrata;
P - stupanj razrjeđenja (20).
Broj leukocita
Norma: 4,0–9,0 × 10 9 / L
Nazvan je porast broja leukocita iznad 9,0 × 10 9 / l
leukocitoza, smanjenje njihovog broja ispod 4,0 × 10 9 / l - leukopenija. Međutim, čak 3,5 × 109 u 1 l leukocita za određeni broj pojedinaca može biti norma. Prema literaturi, takvi ljudi imaju povećanu imunološku otpornost i manje je vjerojatno da će se razboljeti, što se čini kao posljedica potrebe za imunološkim odgovorom da ima rezervu leukocita u tkivima, gdje je 50 do 60 puta više nego u krvotoku. Očigledno, kod zdravih osoba s niskim brojem bijelih krvnih stanica u perifernoj krvi, njihove rezerve u tkivima se odgovarajuće povećavaju. Ovaj fenomen objašnjava se nasljednim i obiteljskim karakterom ili povećanjem utjecaja parasimpatičkog živčanog sustava.
Leukopenija može biti funkcionalna i organska.
Funkcionalna leukopenija povezana je s poremećenim reguliranjem stvaranja krvi i primjećuje se:
- s nekim bakterijskim i virusnim infekcijama (tifus, gripa, velike boginje, rubeola, Botkinova bolest, ospice);
- pod djelovanjem lijekova (sulfonamidi, analgetici, antikonvulzivi, antitireoidni, citostatički i drugi lijekovi);
- tijekom mišićnog rada, uvođenja stranih bjelančevina, živčanih i temperaturnih učinaka, gladovanja, hipotoničnih stanja;
- lažna leukocitopenija može biti povezana s agregacijom leukocita tijekom dugotrajnog skladištenja krvi na sobnoj temperaturi (više od 4 sata).
Organska leukopenija nastala kao rezultat aplazije koštane srži i njezine zamjene masnim tkivom nastaje kada:
- aplastična anemija;
- agranulocitoza;
- leukopenijska leukemija;
- neki oblici Hodgkinove bolesti;
- ionizirajuće zračenje;
- hipersplenizam (primarni i sekundarni);
- bolesti kolagena.
leukocitoza
Leukocitoza je reakcija hematopoetskog sustava na učinke
egzogeni i endogeni čimbenici. Postoje fiziološke i patološke leukocitoze.
Fiziološka leukocitoza je:
- probavni - nakon jela, osobito bogato proteinima; broj leukocita ne prelazi 10,0 - 12,0 × 10 9 / l, a nakon 3-4 sata se vraća u normalu;
- s emocionalnim stresom (adrenalin), teškim fizičkim naporom, hlađenjem, prekomjernim izlaganjem suncu (opeklinama od sunca), davanjem niza hormona (kateholamina, glukokortikosteroida, itd.), u drugoj polovici trudnoće, tijekom menstruacije i zbog nejednake raspodjele leukocita u krvi mainstream.
Patološka leukocitoza je podijeljena na apsolutnu i relativnu.
Apsolutna leukocitoza - povećanje broja leukocita u krvi do nekoliko stotina tisuća (100,0–600,0 × 10 9 / l i više).
- Najčešće se opaža kod leukemije: u kroničnoj leukemiji - u 98-100% slučajeva, s akutnom leukemijom - u 50-60%. Promjena u omjeru leukocitnih stanica u koštanoj srži i punktatu krvi služi kao osnova za dijagnozu leukemije.
Uočena je relativna leukocitoza:
- akutni upalni i infektivni procesi, s iznimkom tifusa, gripe, velikih boginja, rubeole, Botkinove bolesti, ospica. Najveća leukocitoza (do 70,0–80,0 × 10 9 / l) opažena je kod sepse;
- pod utjecajem otrovnih tvari (otrovi insekata, endotoksini), ionizirajućeg zračenja (odmah nakon zračenja);
- kao rezultat djelovanja kortikosteroida, adrenalina, histamina, acetilkolina i preparata digitalisa;
- s raspadom tkiva (nekroza), infarktom miokarda, trombozom perifernih arterija s razvojem gangrene, opekotina, eksudativnog pleuritisa, perikarditisa, uremije, jetrene kome;
- značajan gubitak krvi kod ozljeda, unutarnjih, ginekoloških i drugih krvarenja.
Povećanje broja leukocita u zaraznim bolestima u većini slučajeva popraćeno je pomakom leukocitne formule u lijevo
Brojanje broja leukocita i trombocita
Čimbenici koji utječu na ispravnost istraživanja bijelih krvnih stanica
- dugo čuvanje krvi na sobnoj temperaturi
Norme broja bijelih krvnih stanica
Dob Broj leukocita
- 1 dan 11,6 - 22,0
- 1 tjedan 8.1.- 14.3
- 1 mjesec 7,6 - 12,4
- Odrasli 4.0 - 9.0
Metode za određivanje broja leukocita u krvi.
- Brojanje broja leukocita u komori za brojanje
- Brojanje leukocita u hematološkim analizatorima
Određivanje broja leukocita u komori za brojanje.
- Brojanje leukocita pod mikroskopom provodi se nakon liziranja crvenih krvnih stanica u 100 velikih kvadrata mreže za brojanje i ponovno izračunava se za 1 litru krvi, na temelju volumena kvadrata i razrjeđenja krvi. Broj leukocita treba uzeti u roku od 2-4 sata nakon uzimanja krvi.
- Ako u perifernoj krvi postoje stanice s nuklearnim stanicama, one se ne liziraju i broje zajedno s leukocitima. U ovom slučaju, da bi se odredio pravi broj leukocita, broj stanica u crvenom redu oduzima se od ukupnog broja prebrojenih stanica.
- Na primjer: Ukupan broj leukocita u izračunu u komori (ili analizatoru) -45x109 / l. Pri izračunavanju formule leukocita, nađeno je da je prisutno 50 eritroblasta (normoblasta) na 100 leukocita.
Izračunavamo pravi broj leukocita u krvi:
150 stanica - 45 x 109 / l
100 stanica (leukociti) - X
X = 100x45x10 / l / 150 = 30x10 / l
Dakle, pravi broj leukocita u krvi je 30 x 109 / l.
Glavni izvori pogrešaka u izračunu leukocita u komori:
- Neispravan omjer volumena krvi i octene kiseline u epruveti.
- Neispravno pripremljena otopina octene kiseline (u koncentraciji većoj od 5%, mogu se lizirati neki leukociti, što će dovesti do podcjenjivanja rezultata).
- Dugotrajno izlaganje uzorka na temperaturama iznad 28 ° C, što može ubrzati lizu leukocita u uzorku i dovesti do podcjenjivanja rezultata.
- Nepravilno punjenje komore Goryaev. Kao i kod izračuna crvenih krvnih zrnaca, fotoaparat treba ostaviti 1 minutu da se stanice slegnu.
- Kamera Goryaev nije bila dobro oprana nakon prethodne definicije. Leukociti koji ostaju u komori mogu precijeniti rezultate analize.
Metode brojanja trombocita
- u komori za brojanje
Svaka skupina metoda ima prednosti i nedostatke.
- Brojanje trombocita u komori je dovoljno precizno, ne zahtijeva izračunavanje broja crvenih krvnih stanica. S druge strane, ova metoda je zahtjevnija, jer su trombociti u izvornom obliku predstavljeni malim i slabo kontrastnim elementima. Nedostatak metode je brojanje trombocita u narednim satima nakon uzimanja krvi.
- Određivanje broja trombocita u razmazu krvi značajno je inferiorno po svojoj točnosti prema komornoj metodi ili automatskim brojačima. Pogreške u brojanju krvnih razmaza mogu biti uzrokovane lošom kvalitetom razmaza i povezanom neravnomjernom raspodjelom trombocita, netočnim određivanjem broja crvenih krvnih stanica. Značajan nedostatak metode je nužnost simultanog brojanja trombocita i crvenih krvnih stanica u krvi. Prednost je u mogućnosti proučavanja trombocita u bilo koje vrijeme, bez obzira na vrijeme prikupljanja krvi.
- Metoda određivanja trombocita pomoću hematološkog analizatora omogućuje točno određivanje broja trombocita, njihovog prosječnog volumena i raspodjele po volumenu.
Broj leukocita
Broj leukocita izračunava se pomoću automatskog brojača ili u Goryaev komori. Za brojanje leukocita u komori, pripravlja se Turk tekućina - otopina octene kiseline obojena s vodenom otopinom metilen plavog (0,1 ml 0,1% -tne otopine metilenskog plavog je dodano u 9 ml 10% octene kiseline). U epruvetu uliti 0,4 ml tekućeg Türka. Steknite točno 0,02 ml krvi, pažljivo dodajte u tekućinu za razrjeđivanje. Razrjeđivanje krvi je 1:20. Dobro promiješajte i ostavite 4 minute. Napunite komoru Goryaeva, nakon što pažljivo protresete epruvetu s razrijeđenom krvlju. Fotoaparat je ostavljen 1 min na ravnoj površini radi taloženja leukocita. Zatim se broje leukociti pri malom povećanju mikroskopa (leća 8, okular 10 ili 15) sa zamračenim vidnim poljem (s spuštenim kondenzatorom ili suženom dijafragmom). Smatra se da su leukociti u 100 neobjavljenih velikih kvadrata, što odgovara 1600 malih. Rezultati brojanja stanica u velikim kvadratima sažimaju i izračunavaju njihov broj u 1 μl krvi pomoću formule:
gdje je X broj leukocita u 1 μl krvi; A - broj stanica u 100 velikih kvadrata, 1600 - broj malih kvadrata; 20 - razrjeđenje krvi; 4000 je množitelj koji rezultira volumenom od 1 μl krvi, na temelju volumena malog kvadrata (1/4000 μl).
Brojanje formule leukocita Ispituje se obojeni razmaz periferne krvi. Neophodan uvjet za ispravno razmatranje morfoloških značajki krvnih stanica je pravilno izrađen i dobro obojen razmaz krvi. Na suhim, čistim, dobro odmašćenim preparatima pripremljen je razmaz krvi koji je staren u smjesi Nikiforov (etilni alkohol 96 º i dietil eter 1: 1). Uzimajući stakleni slajd za duge rubove, dodirnite njegovu površinu kapom krvi (ali ne i kožom) koja je oslobođena od uboda, ili nanesite kap krvi s mikropipetom ili kapilarom. Na stolu ili u lijevoj ruci se drži stakleni klizač za uske rubove. Desnom rukom nanesite brušeno staklo uz uski rub na staklo s krvlju lijevo od kapi pod kutom od 45 ° i gurnite ga udesno dok ne dodirne krv. Oni čekaju da se krv širi cijelim rubom brušenog stakla, a zatim ga brzo, brzo pomiče, odvodi s desna na lijevo dok se cijela kapljica ne iscrpi. Kap krvi trebala bi biti mala i proporcionalna, tako da se cjelokupni razmaz stavi na staklo, a ne do 1-1,5 cm prije ruba. Dobro napravljen razmaz je tanak, ima žućkastu boju i završava u "metli". Zrakom osušeni razmaz krvi stavlja se u posebne posude za fiksaciju ili u obične staklene čaše napunjene tekućinom za fiksiranje (metil alkohol, vrijeme fiksacije 3-5 minuta; etilni alkohol, 30 minuta; smjesa Nikiforova, 20-30 minuta). Fiksni pripravci se osuše u zraku, a zatim oboje bojom Romanovsky-Giemsa. Gotova otopina boje Romanovsky-Giemsa (azureosin) razrijeđena je 1:10 u potrebnom volumenu za bojenje. Fiksni razmazi se uliju razrijeđenom bojom koja se slijeva na razmaz s višim slojem. Bojanje traje ovisno o temperaturi zraka u prostoriji od 25 do 45 minuta. Nakon završetka boje, isperite boju destiliranom vodom i stavite udarce okomito u drveni stalak za sušenje. Mikroskopija razmaza krvi provodi se uranjanjem pri uvećanju 100 × 10. Brojanje leukocita provodi se uzduž cik-cak linije ("Meander linija"), broji se 100-200 stanica, uzimajući u obzir broj pojedinačnih oblika leukocita: ubodni i segmentirani neutrofili, eozinofili, bazofili, monociti, limfociti. Izračunajte postotak svakog tipa ćelije.
Brojanje apsolutnog broja fagocita i limfocita Apsolutni broj fagocita (neutrofila i monocita) i limfocita viših kralježnjaka izračunava se na temelju podataka o broju leukocita u perifernoj krvi i leukocitnoj formuli.
Test fagocitne funkcije
Određivanje fagocitnog indeksa i fagocitnog broja
Razvijen je veliki broj tehnika za procjenu aktivnosti apsorpcije i digestije leukocita. Svi se oni temelje na sposobnosti fagocita da apsorbiraju strane čestice koje čine testni sustav (specifična vrsta mikroorganizama, zimosan, lateks - objekt apsorpcije). Otkrivanje se izvodi in vitro ili in vivo. Opći tijek određivanja je sljedeći: Heparinizirana ili citrirana svježa krv (ili suspenzija fagocita) pomiješana je s jednakim volumenom suspendirane dnevne mikrobne suspenzije (Saccharomyces cerevisiae, Staphilococcus aureus, S. albus, E.coli, A. nydrophila) ili drugog apsorpcijskog objekta. Smjesa se lagano promiješa i stavi u termostat (37-40ºS - za toplokrvno ovisno o normalnoj temperaturi tijela, 26 ° C - za ribe koje vole toplinu i niže za hladno-ljubavno). Nakon 15, 30, 45, 60 i 90 minuta pripravljaju se razmazi na predmetnim pločicama, suše, fiksiraju s metilnim alkoholom ili smjesom Nikiforova i obojene prema Romanovsky-Giemsi. Oni gledaju na mrlje pod potapanjem i određuju fagocitnu aktivnost - postotak fagocita koji sudjeluju u fagocitozi, fagocitni indeks - broj probnih mikroba uhvaćenih jednim fagocitnim leukocitima, fagocitni broj - prosječan broj fagocitnih objekata na 1 aktivni neutrofil. Evaluacija pokazatelja u različitim vremenskim intervalima omogućuje nam da ocijenimo dinamiku fagocitoze. Normalno, nakon 90 minuta, fagocitni indeks bi trebao biti niži nego nakon 45 minuta i 60 minuta zbog probave mikroba. U slučaju povrede probave, to se ne mijenja.
Procjena funkcionalne aktivnosti fagocita reakcijom redukcije nitro-plavog tetrazola (NBT-test)
Ovaj test je pokazatelj baktericidne funkcije fagocita i omogućuje procjenu njihove sposobnosti ubijanja ovisno o kisiku. Kada se taj mehanizam ubijanja aktivira, aktivira se enzim NADPH oksidaza, što dovodi do pojave reaktivnih kisikovih vrsta u fagocitima. Oslobađanje takvih tvari u stanici naziva se kisikova (respiratorna) eksplozija, koja se može registrirati pomoću NBT testa. U formulaciji ovog testa u fagocite se dodaje supstanca nitrosinium tetrazolium, koja se apsorbira u stanici i, u prisutnosti reaktivnih vrsta kisika, pretvara se u tamno plavu tvar, diformazan. Što su tamnije plave granule fiksirane na površini ili unutar fagocita, formiraju se aktivniji oblici kisika, što je više ovisno o kisiku.
NBT test postavljen je u dvije verzije: spontano i inducirano. Kod postavljanja spontanog NBT-testa, fagociti se uzgajaju u prisutnosti NST-a bez prethodne aktivacije stanica, pri izvođenju induciranog NBT-testa, aktivator fagocitne reakcije se dodaje u medij kulture. Postavljanje NBT testa u dvije varijante omogućuje izračun funkcionalne rezerve stanica, što je razlika između broja (intenziteta) induciranih diformazan-pozitivnih stanica i broja (intenziteta) spontanih diformazan-pozitivnih stanica. Vrijednosti induciranog NBT testa karakteriziraju aktivnost fagocitnih stanica u prisutnosti antigenskog stimulusa i smatraju se kriterijem njihove spremnosti za potpunu fagocitozu. Spontani NBT-test omogućuje procjenu stupnja aktivacije mehanizama ubijanja ovisnih o kisiku ne-aktiviranih fagocita. Karakterizira stupanj aktivacije unutarstaničnih mikrobicidnih sustava.
Za formiranje spontanog NBT testa, u 0,1 ml krvi dodano je 0,05 ml 0,2% otopine NBT u kalijevom fosfatnom puferu (0,1, pH 7,3) i 0,05 ml istog pufera. Paralelno, uzorak se stavlja na račun induciranog NBT testa, u kojem se umjesto 0,05 ml pufera dodaje isti volumen fagocitnog aktivatora (na primjer, pirogenal u koncentraciji od 50 μg / ml). Reakcijska smjesa je termostirana u vodenoj kupelji na 37 ° C (30-60 min). Izrađuje se razmaz srednje gustoće, suši na zraku i fiksiran u smjesi etilnog alkohola ili Nikiforova (20 min), a zatim obojen vodenom otopinom neutralnog crvenog (0.1%, 1 min).
Nakon reakcije mikroskopiraju se razmazi krvi uronjeni (100 × objektiv, 10 × okular). Među 100 stanica, broji se omjer aktiviranih neutrofila (DAN,%) koji sadrže granule diformazana. Sukladno količini diformazana deponiranog u stanicama, njihova aktivnost se procjenjuje u proizvoljnim jedinicama i izračunava se indeks aktivacije neutrofila (IAN, korištene jedinice):
gdje je Hneg. - broj stanica koje ne sadrže granule diformazana;
H1 - broj stanica u kojima je područje depozita diformazana manje od 1/3 površine jezgre;
H2 - broj stanica u kojima se depoziti diformazana kreću od 1/3 do ukupne veličine jezgre;
H3 - broj stanica u kojima diformazanska naslaga zauzimaju veće područje jezgre.
Izvedba koeficijenta mobilizacije (KM) izvršena je prema sljedećoj formuli: