Biokemijska dijagnostika bolesti jetre. Kratke informacije o strukturi jetre.

Jetra je nepareni organ težine 1300-1800 g. Više od 60% stanica jetre su parenhimske stanice - hepatociti, 25% su stanice retikulohistiocitnog sustava (CSG), endotelne ili Kupferove stanice, ostatak je duktalna, vezivno tkivo i druge stanice.

Strukturna i funkcionalna jedinica jetre je jetreni akinus ili jetreni lobulat, koji se formira prvenstveno iz hepatocita (slika 1). U središtu jetrene lobule nalazi se hepatična vena iz koje zrače zrake jetre, koje se uglavnom sastoje od jednog reda hepatocita. Jetrena vena nalazi se u središtu lobule, a na periferiji nalazi se portalno polje s granama jetrene arterije, portalnom venom i najmanjom žučnom kapilarom. Između greda su raširene kapilare - sinusi jetre. Hepatociti koji tvore grede, s jedne strane, nazivaju vaskularnim stupom, suočavaju se sa sinusima, a invaginacije membrane susjedne strane, nazvane bilijarnim (žučnim) stupom, formiraju primarne žučne kapilare (Slika 2). Karakteristična značajka kanalikula žuči je njihova potpuna izolacija od krvnih kapilara. Kroz membranu vaskularnog stupa endocitozu i egzocitozu raznih molekula, a bilijarnu - oslobađanje tvari iz stanice. Portalna vena i jetrena arterija ulaze u jetru, a jetrena i žučna žila izlaze.

Acini je podijeljen u 3 funkcionalne zone: u 1 zoni nalaze se stanice uz portalni trakt, bolje su opskrbljene kisikom i hranjivim tvarima. Stanice treće zone, smještene oko jetrene vene, manje su opskrbljene kisikom i supstratima i osjetljivije su na ishemiju. Stanice ove zone su uključene u metabolizam lijekova i cilj su za hepatotoksične lijekove.

Kod provođenja laboratorijskih ispitivanja za ispravnu dijagnozu važno je znati raspodjelu enzima unutar stanice. Slijede podaci o enzimima koji se najčešće koriste za dijagnozu.

citoplazma sadrži alanin aminotransferazu (ALT), dio aspartat aminotransferaze (AST), laktat dehidrogenazu (LDH), dio gamaglutamiltranspeptidaze (GGT) i druge enzime.

U mitohondrijima (MX) većina koncentracija AST (oko 70%), glutamat dehidrogenaze (GLDG), alkohol dehidrogenaze i mnogi drugi su koncentrirani.

Grubi endoplazmatski retikulum sadrži kolinesterazu (CE), itd.

U glatkom endoplazmatskom retikulumu su glukoza-6-fosfataza, UDP-glukuroniltransferaza, membranski vezani citokrom P-450 koji sadrži rub i druge.

lizosomi sadrže kiselinske hidrolaze (kisela fosfataza, ribonukleaza, itd.), koje se aktiviraju snižavanjem pH vrijednosti u stanici.

Mikrovalovi bilijarnog pola sadrže enzime ovisne o membrani, kao što su alkalna fosfataza (alkalna fosfataza), 5-nukleotidaza, dio GGT, leucin aminopeptidaza (LAP).

Poznavanje arhitektonije jetre i raspodjele enzima unutar stanice jasno ukazuje na nejednako povećanje aktivnosti enzima u različitim patološkim procesima. Dakle, s prevladavajućom lezijom središnjih dijelova lobula (akutni alkoholni hepatitis, akutna venska zastoj, itd.), Aktivnost mitohondrijske glutamat dehidrogenaze se povećava - nedostatak kisika i MX oštećenja, a kod poraza portalnog trakta (akutni virusni hepatitis, kronični aktivni hepatitis - CAG). aktivnost citoplazmatske transaminaze.

Biokemijska dijagnostika bolesti

Podaci za kontakt
Roba i usluge
popravci

Klinička biokemija, zajedno s patološkom i normalnom fiziologijom, jedan je od tri kitova osnovne medicinske znanosti. Bez znanja o osnovama ove discipline, liječnik se ne razlikuje od školarca koji ima ideju o bolestima samo na temelju simptoma i znakova.

U međuvremenu, klinički i biokemijski pokazatelji koji prate promjene u stanicama na razini molekula i kemijskih reakcija, omogućuju pouzdano utvrđivanje uzroka patoloških stanja tijela kao cjeline. O razini osposobljenosti kliničara ovisi koliko će kompetentno pristupiti odabiru potrebnih biokemijskih analiza za sveobuhvatni pregled pacijenta, te će također moći ocijeniti njihove dijagnostičke informacije, vrijednost i pouzdanost.

U medicini, laboratorijske biokemijske studije naširoko se koriste za:

- davanje točne dijagnoze,

- otkrivanje bolesti u predkliničkoj fazi,

- procijeniti učinkovitost propisanog liječenja,

- praćenje stanja bolesnika

- predviđanje mogućih komplikacija i ishoda bolesti.

Preporučeni biokemijski testovi

Razvijene su standardizirane istraživačke metode za glavne sustave tijela, koje se moraju provesti bez problema s odgovarajućim kompleksom simptoma:

Patologija kardiovaskularnog sustava.

Angina pektoris (koagulogram, kolesterol s frakcijama, aminotransferaze, trigliceridi, frakcije lipoproteina, aterogeni indeks, laktat dehidrogenaza s izoenzimima, kreatin kinaza s izoenzimima);

Hipertenzija (kolesterol s frakcijama, kolinesteraza, urea, mokraćna kiselina, kreatinin, trigliceridi, aterogeni indeks, razina elektrolita K i Na);

Ateroskleroza (kolesterol s frakcijama, frakcije lipoproteina, trigliceridi, aterogeni indeks);

Infarkt miokarda (stresni proteini, kreatin kinaza s izoenzimima, aminotransferaze, urea, kolinesteraza, koagulogram, mokraćna kiselina, laktat dehidrogenaza s izoenzimima);

Hipotenzija (17OKS, sadržaj hidrokortizona u urinu).

Patologija sustava vezivnog tkiva.

Reumatizam (ukupni protein s frakcijama proteina, glikoproteini, testovi sedimenta, stresni proteini, heksoze glikoproteina, fibrinogen, sijalne kiseline);

Reumatoidni artritis (protein zajednički s proteinskim frakcijama, glikoproteini, sialične kiseline);

Giht (ukupni protein s proteinskim frakcijama, kreatinin, urinska kiselina, stresni proteini, glikoproteini);

Skleroderma (ukupni protein s proteinskim frakcijama, fibrinogen, stresni proteini, hidroksiprolin).

Patologija bilijarnog i gastrointestinalnog sustava.

Žučni kamenac (bilirubin s frakcijama, alkalna fosfataza, Y-glutamil transpeptidaza);

Atrofični gastritis (pepsinogen, gastrin);

Kronični pankreatitis (glukoza, tolerancija glukoze, ukupni protein s proteinskim frakcijama, amilaza s izoenzimima, lipaza u mokraći i krv);

Nekroza gušterače (amilaza);

Distrofično-degenerativne promjene u jetri, masnom obliku (urea, glutamat dehidrogenaza, alanin aminotransferaza, kolinesteraza, aspartat aminotransferaza);

Ciroza jetre (urea, kolesterol, aspartat aminotransferaza, kreatinin, alanin aminotransferaza, proteinske frakcije, β lipoproteini, sedimentni uzorci);

Kronični hepatitis (istovjetna istraživanja kao kod ciroze, plus laktat dehidrogenaza s izoenzimima, ukupni protein, alkalna fosfataza);

Hepatitis je akutan (isto istraživanje kao iu kroničnom obliku, s iznimkom alkalne fosfataze i ureje).

Patologija dišnog sustava.

Apsces pluća, akutni bronhitis, bronhijalna astma (ukupni protein s frakcijama, protein-stres);

Bronhiektazije (iste, plus fibrinogen);

Kronična upala pluća (ukupni protein s frakcijama, stresni protein, laktat dehidrogenaza s izoenzimima);

Akutna upala pluća (isto kao i kronična, plus glikoproteini, sedimentni uzorci, sijalne kiseline)

Tuberkuloza (ukupni protein s frakcijama, stresni protein, sialične kiseline, glikoprotein, uzorci sedimenta).

Patologija mokraćnog sustava.

Zatajenje bubrega, akutni i kronični (ukupni protein s frakcijama, kreatinin, protein urina, urea, sadržaj elektrolita Na, Cl, K, Ca);

Bolest bubrega (isto kao iu slučaju insuficijencije, plus mokraćna kiselina i elektrolit P, s izuzetkom Cl);

Nefrotski sindrom (isti kao kod insuficijencije, plus elektrolit Mg, izuzev Cl);

Amiloidoza bubrega (isto kao i kod insuficijencije, plus elektrolit Mg, izuzev Cl i Y - glutamil transpeptidaze);

Kronični pijelonefritis (zajednički protein s frakcijama, stresni proteini, alkalna fosfataza, kolinesteraza, protein urina, Y-glutamil transpeptidaza);

Glomerulonefritis (ukupni protein s frakcijama, stresni proteini, urea, Y-glutamil transpeptidaza, kreatinin, laktat dehidrogenaza s izoenzimima, kolinesteraza).

Patologija endokrinog sustava.

Šećerna bolest (glukoza u mokraći i krv, inzulin, aceton, kolesterol, beta-lipoproteini, s vjerojatnošću skrivenog oblika - test osjetljivosti na glukozu);

Dijabetes bez šećera (glukoza, vazopresin, test tolerancije glukoze);

Hipoparatireoidizam (alkalna fosfataza, sadržaj elektrolita K i P u krvi i urinu);

Hipotireoza (tiroksin, trijodtironin, trigliceridi, beta-lipoproteini, kolesterol, urea);

Gnojni tiroiditis (tiroksin, trijodtironin, stresni proteini, ukupni protein s frakcijama);

Autoimuni tiroiditis (tiroksin, trijodtironin, apsorpcija joda131 od strane štitne žlijezde, jod koji je vezan za protein);

Joj je endemska (isto kao i kod autoimunog oblika tiroiditisa, plus kolesterol i urea u urinu);

Goit difuzno, toksično (tiroksin, trijodtironin, TSH, vezani za jodne proteine, glukoza, urea, kolesterol).

Ako liječnik smatra da je to potrebno, pored glavnih dodatnih laboratorijskih testova se imenuju. (Pogledajte tretman)

Dekodiranje biokemijske analize krvi

Što pokazuje biokemijski test krvi?

Krv je jedan od tjelesnih biomaterijala. Prisutna je u svim organima i tkivima. Njegov sastav obuhvaća tvari koje nastaju tijekom rada svih organa. Test krvi za biokemiju određuje prisutnost i razinu njegovih komponenti.

Uspoređujući podatke dijagnostike i normalnih vrijednosti, moguće je odrediti funkcionalno stanje organa, odrediti prirodu patologija koje se u njima javljaju. Kod nekih bolesti, biokemija krvi je jedini način da se objektivno potvrdi dijagnoza.

Osim glavnih (glukoza, hemoglobin, kreatinin, kolesterol i drugi), biokemijska analiza otkriva i specifične pokazatelje (elektrolite, serum, reumatoidni faktor i dr.) Neophodne za dijagnosticiranje endokrinoloških i genetskih bolesti. Metoda je također primjenjiva u pedijatriji, sportskoj medicini za procjenu funkcionalnog stanja tijela djece, sportaša.

Koje su indikacije za biokemijsku analizu krvi?

Često je biokemija propisana u bolesnika ili ambulantno. Test krvi se provodi kako bi se dijagnosticirala ili pratila učinkovitost liječenja. Liječnik pojedinačno određuje popis pokazatelja čija se razina mora postaviti u bolesnika. To može biti jedan pokazatelj (na primjer, glukoza u šećernoj bolesti) ili nekoliko (na primjer, testovi funkcije jetre - ukupni protein, bilirubin, protrombinski indeks, ALT, AST - u hepatitisu).

Indikacije za istraživanje su bolesti:

hepatobilijarni sustav;
bubrege;
endokrini sustav;
srce;
muskuloskeletni sustav;
cirkulacijski sustav;
gastrointestinalnog trakta.

U kombinaciji s metodama instrumentalne dijagnostike, biokemija krvi pomaže u postavljanju ispravne dijagnoze u patologiji svih unutarnjih organa.

Kako uzeti test krvi za biokemiju?

Biokemijska analiza ispituje vensku krv. Uzmite biomaterijal iz perifernih (ulnarnih ili radijalnih) vena. S ograničenim pristupom podlaktici (prijelomi, opekline itd.), Krv se uzima iz bilo koje druge vene (na rukama, nogama, nogama).

Prije provođenja analize, pacijent treba pripremiti:

8 sati prije davanja krvi ne može se jesti, piti pića koja sadrže šećer;
2 dana morate se suzdržati od alkohola i masne hrane;
uoči istraživanja izbjeći fizički i emocionalni stres.

Analiza se provodi prije lijekova, prije dijagnostičkih i terapijskih postupaka (rendgenski pregled, fizioterapija itd.).

Mjesto uboda kože se tretira antiseptičnom otopinom etilnog alkohola od 96% ili vodikovim peroksidom. Krv u volumenu od 5-10 ml sakupljena je u sterilnoj suhoj epruveti, koja je poslana u studiju.

Norme biokemijske analize krvi (tablica)

Norm u odraslih

Kod djece mlađe od 14 godina

Ukupni bilirubin (tbil)

do 250 µmol / l (novorođenčad)

Izravni bilirubin (idbil)

Alkalna fosfataza (alp)

Lipoproteini VP (HDL)

Do 6 g / l (tijekom trudnoće)

Mokraćna kiselina (mokraćna kiselina)

C-reaktivni protein (crp)

Antistreptolizin O (također također)

Kako dešifrirati biokemijsku analizu?

Dešifriranje biokemijske analize krvi je usporedba dobivenih rezultata s normama pokazatelja. Obrazac za analizu sadrži kompletan popis tvari određenih biokemijskim laboratorijem i njihove referentne vrijednosti. Ponekad je dovoljno uspostaviti konačnu dijagnozu na temelju odstupanja od norme jednog ili više parametara. No češće je potrebno potvrditi da su vam potrebni dodatni rezultati istraživanja. Sljedeća će se razmatrati, što znači odstupanje od normi glavnih pokazatelja biokemije krvi, za koje je bolesti tipično.

Ukupni protein

Ukupni protein je skup proteina u krvnoj plazmi. Njegova razina pomaže identificirati bolesti unutarnjih organa i krvi. Indikator raste u uvjetima:

dehidracija tijela (povraćanje, proljev, opekline itd.);
akutne i kronične infekcije;
onkološke bolesti.

Razina ukupnih proteina opada s:

nedostatak proteina tijekom posta;
bolesti jetre;
akutno i kronično krvarenje;
tireotoksikoza.

bilirubin

Bilirubin je žučni pigment koji nastaje uslijed razaranja crvenih krvnih stanica. Do metabolizma dolazi uslijed normalne funkcije jetre. Njegova razina varira s bolestima jetre, žučnim sustavom, anemijom. Bilirubin je slobodna i vezana frakcija. Povećanje prvog pokazatelja nastaje kada:

akutni virusni, toksični, liječni hepatitis;
bakterijska oštećenja jetre (leptospiroza, bruceloza itd.);
tumori jetre, primarna bilijarna ciroza;
hemolitička anemija.

Povećani sadržaj vezanog bilirubina tipičan je za bolesti koje ometaju protok žuči:

bolest žučnih kamenaca;
tumor gušterače;
upalne bolesti bilijarnog trakta, itd.

enzimi

Enzimska aktivnost karakterizira stanje unutarnjih organa. Povećana učinkovitost s porazom organskih stanica. Povećanje razine aminotransferaze ALAT, ALAT nastaje kada:

akutni, kronični hepatitis;
nekroza jetre;
infarkt miokarda;
ozljede i bolesti skeletnih mišića;
kolestaza;
teška hipoksija tkiva.

Povišene razine laktat dehidrogenaze (LDH) tipične su za:

infarkt miokarda, bubreg;
miokarditis;
opsežna hemoliza;
plućna embolija;
akutni hepatitis.

Visoke razine kreatin fosfokinaze (CPK) mogu se pojaviti kada:

infarkt miokarda;
nekroza skeletnih mišića;
epilepsije;
miozitis i mišićna distrofija.

Urea pripada grupi supstrata - spoja niske molekularne mase koji se sintetizira u jetri. Razina tvari u krvi ovisi o sposobnosti filtriranja bubrega i sintetskoj funkciji jetre. Razlozi za povećanje:

bolesti bubrega (glomerulonefritis, amiloidoza, pielonefritis, liječenje nefrotoksičnim lijekovima);
kardiovaskularno zatajenje;
masivni gubitak krvi;
opekline;
kršenje odljeva urina;
konzumiranje viška proteina.

Razlozi smanjenja razine ureje:

post i strogo vegetarijanstvo;
trovanje otrovima;
trudnoća;
kršenje sintetske funkcije jetre.

Mokraćna kiselina

Mokraćna kiselina je krajnji proizvod metabolizma određenih proteina. Njegov glavni dio se izlučuje putem bubrega, a ostatak - s izmetom. Povećanje razine mokraćne kiseline u krvi pokazuje sljedeća stanja:

zatajenje bubrega;
leukemija;
limfom;
produljeni post;
zlouporaba alkohola;
predoziranja salicilatima i diureticima.

Koliko je biokemijski test krvi?

Trošak biokemijskih ispitivanja krvi ovisi o broju određenih parametara. Cijena svake od njih se kreće od 130-300 rubalja. Najskuplja metoda biokemijskih testova krvi je imunoelektroforeza, čija je cijena u nekim klinikama 1000 rubalja.

Biokemija i patobiokemija jetre. Biokemijska dijagnoza bolesti jetre

Biokemijska dijagnostika bolesti jetre.

BIOKEMIJSKA DIJAGNOSTIKA BOLESTI ŽIVOTA.

Kratke informacije o strukturi jetre.

Kod provođenja laboratorijskih ispitivanja za ispravnu dijagnozu važno je znati raspodjelu enzima unutar stanice. Slijede podaci o enzimima koji se najčešće koriste za dijagnozu.

citoplazma sadrži alanin aminotransferazu (ALT), dio aspartat aminotransferaze (AST), laktat dehidrogenazu (LDH), dio gamaglutamiltranspeptidaze (GGT) i druge enzime.

U mitohondrijima (MX) većina koncentracija AST (oko 70%), glutamat dehidrogenaze (GLDG), alkohol dehidrogenaze i mnogi drugi su koncentrirani.

Grubi endoplazmatski retikulum sadrži kolinesterazu (CE), itd.

U glatkom endoplazmatskom retikulumu su glukoza-6-fosfataza, UDP-glukuroniltransferaza, membranski vezani citokrom P-450 koji sadrži rub i druge.

lizosomi sadrže kiselinske hidrolaze (kisela fosfataza, ribonukleaza, itd.), koje se aktiviraju snižavanjem pH vrijednosti u stanici.

Mikrovalovi bilijarnog pola sadrže enzime ovisne o membrani, kao što su alkalna fosfataza (alkalna fosfataza), 5-nukleotidaza, dio GGT, leucin aminopeptidaza (LAP).

Jetra se naziva središnji metabolički laboratorij, jer jednako učinkovito pretvara tvari koje dolaze iz crijeva i metaboličkih proizvoda nastalih u različitim organima i tkivima kao rezultat njihove vitalne aktivnosti. Trenutno je poznato više od 500 metaboličkih funkcija. Ukratko razmotrite glavne.

1. Sintetička. Jetra sintetizira bjelančevine, enzime, faktore koagulacije, kolesterol, fosfolipide itd. Glavna formacija ketonskih tijela događa se u jetri.

2. Detoksikacija za endogenog (amonijak, bilirubin, itd.). i egzogeni (droge, itd.) tvari. Detoksifikacija lijekova uključuje 2 faze: 1 - modifikaciju lijekova u redoks reakcijama pomoću citokroma P 450, te konjugaciju lijekova s vodotopivim tvarima dodavanjem glukurona, sumpornih kiselina, glutationa itd. U slučaju bolesti jetre, reakcije prve faze su smanjene ili ih nema.

3. Sekretarijat - sekrecija žuči. Uređaj za sekreciju žuči uključuje žučne kanaliće, mikrovile, susjedne lizosome i Golgijev kompleks. Mehanizam izlučivanja žuči uključuje oslobađanje kolesterola, žučnih kiselina, pigmenata, fosfolipida u obliku specifičnog makromolekularnog kompleksa - žučne micele. Primarne žučne kiseline nastale u jetri ulaze u crijevo, gdje se djeluju crijevne flore pretvaraju u sekundarne žučne kiseline. Potonji se apsorbiraju u crijevima i ponovno ulaze u jetru (enterohepatična cirkulacija). Jetra ih konjugira s glicinom i taurinom, pretvarajući ih u amfifilne spojeve s visokom sposobnošću emulgiranja hidrofobnih. tvari. Bilo koji procesi koji uzrokuju kršenje omjera komponenti u žuči (hormonalni, upalni, itd.), Dovode do kršenja sekrecije žuči - kolestaze.

4. Izlučivanje - izlučivanje s žuči raznih tvari, uključujući krutine.

Jetra sudjeluje u svim vrstama metabolizma.

1. Izmjena proteina. Jetra sintetizira sljedeće proteine:

albumin 100%, fibrinogen

₁-globulini 90%, faktori zgrušavanja krvi

₂-globulini 75% (uključujući ovisnost o vitaminu K)

Glob-globulini 50%, pseudokolinesteraza (CE)

Albumin pripada najlakšim krvnim proteinima, OMM 65-70 kD i sintetiziran je isključivo jetrom. Albumini održavaju onkotski tlak, pad njihovog sadržaja dovodi do edema. Ako smanjenje koncentracije albumina nije povezano s pothranjenošću, povredom crijevne apsorpcije ili velikim gubitkom proteina, to je zbog izrazitog smanjenja funkcije jetre. Albumini imaju važnu ulogu u transportu tvari koje su slabo topljive u vodi (hidrofobne). Takve tvari uključuju bilirubin, kolesterol, masne kiseline, brojne hormone i lijekove. Povreda transportne funkcije albumina dovodi do mnogih patoloških promjena.

Jetra održava razinu aminokiselina, uklj. ciklički (tirozin, triptofan, fenilalanin,), neutralizira amonijak, pretvarajući ga u ureu. Sinteza uree je jedna od najstabilnijih funkcija jetre.

2. Razmjena lipida. Sinteza kolesterola 90% provodi jetra i crijeva. Značajan dio kolesterola u jetri pretvara se u žučne kiseline, steroidne hormone, vitamin D₂. Jetra pretvara masne kiseline kratkog lanca koje su toksične za mozak (4-8 atoma ugljika - kaproinska, izovalerična kiselina itd.) U masne kiseline dugog lanca (16-18 atoma ugljika).

3. Razmjena ugljikohidrata. Jetra održava stabilnu razinu glikemije glikogenezom, glikogenolizom, glukoneogenezom. Jetra proizvodi inzulinaze - enzime koji razgrađuju inzulin, podupiru razinu mliječne i piruvične kiseline.

4. Pigmentni metabolizam uključuje pretvorbu u hepatocite konjugacijom s glukuronskom kiselinom toksičnog, masno topljivog neizravnog bilirubina u netoksičnu, izravno topljivu vodu. Oslobađanje bilirubinga glukuronida može se dogoditi bilo izravnim izlučivanjem u žučnu kapilaru, ili ugradnjom u žučnu micelu.

5. Metabolizam porfirina uključuje sintezu hema koji se sastoji od kompleksa protoporfirina s željezom. Heme je neophodan za sintezu jetrenih enzima koji sadrže heme (citokromi, itd.). Kongenitalna abnormalnost sinteze hema u jetri dovodi do bolesti - jetrene porfirije.

6. Razmjena hormona. Kod bolesti jetre uočava se povećanje razine hormona, povezano s kršenjem njihovog izlučivanja žučom ili poremećajem normalnog metabolizma hormona (nedovoljno uništavanje). Povećana je razina adrenalina i noradrenalina (medijatori simpatičkog živčanog sustava), mineralokortikoid aldosteron, spolni hormoni, posebno estrogeni, hormoni tkiva serotonin i histamin.

7. Zamjena elemenata u tragovima. Jetra sintetizira proteine za transport (transferin) i taloženje (feritin) željeza, a također je i glavno skladište željeza. Jetra igra važnu ulogu u metabolizmu bakra: sintetizira ceruloplazmin, glikoprotein koji veže do 90% bakra u krvi, a također apsorbira bakar koji je labavo vezan za albumin iz krvne plazme i izlučuje višak bakra kroz lizosome s žučom u crijevo. Jetra sudjeluje u razmjeni drugih elemenata u tragovima i elektrolita.

Glavni sindromi kod bolesti jetre.
U raznim bolestima jetre poremećeni su određeni oblici metabolizma ili određene funkcije organa. Neke bolesti popraćene su prevladavajućim oštećenjem stanica jetre. drugi - primarni kršenje odljeva žuči, itd., tako da dijagnoza bolesti jetre često se provodi sindrom. U nastavku su opisani glavni sindromi (tablica 7).

1. Citolitički sindrom (citoliza) nastaje kao rezultat poremećaja strukture stanica jetre, povećanja propusnosti membrane, u pravilu, zbog povećanih procesa peroksidacije lipida (LPO) i oslobađanja enzima u krv. U citolitičkom sindromu u krvotok ulaze i citoplazmatske i mitohondrijske komponente enzima, ali citoplazmatski izoenzimi određuju glavnu razinu aktivnosti. Citoliza uglavnom prati akutna oboljenja jetre i povećava se s pogoršanjem kroničnih bolesti. Razlikuju se sljedeći glavni mehanizmi citolize:

1) toksična citoliza (virusna, alkoholna, lijek);

2) imunološka citoliza, uklj. autoimuni;

4) hipoksično ("šok-jetre" itd.);

5) citoliza tumora;

6) citoliza povezana s nutritivnim nedostacima i neadekvatnošću hrane.

Citoliza nije identična s nekrozom stanica: tijekom citolize, stanica ostaje živa i sposobna za različite tipove metabolizma, uključujući sintezu enzima, stoga se tijekom citolize aktivnost enzima može povećati za desetke ili stotine puta i ostati povišena dugo vremena. Nekroza podrazumijeva staničnu smrt, tako da porast aktivnosti enzima može biti značajan, ali kratkotrajan.

Glavni raspoloživi biljezi citolize u akutnom hepatitisu su alanin (ALT) i aspartanske (AST) transaminaze, gama-glutamil transpeptidaza (GGT), laktat dehidrogenaza (LDH).

Povećana ALT i AST opaženo u 88-97% bolesnika ovisno o tipu hepatitisa, više od polovice njih, postoji značajno (10-100 puta) povećanje. Maksimalna aktivnost je karakteristična za 2-3. Tjedan bolesti, a povratak u normalu je 5-6 tjedan. Nepovoljan faktor je prekoračenje normalizacije aktivnosti. ALT aktivnost> AST, koja je povezana s distribucijom AST između citoplazme i mitohondrija. Dominantno povećanje AST povezano je s mitohondrijskim oštećenjem i opaženo je s ozbiljnijim oštećenjem jetre, osobito alkoholom. Aktivnost transaminaza se umjereno (2-5 puta) povećava kod kroničnih bolesti jetre, obično u akutnoj fazi i tumorima jetre. Za cirozu jetre općenito nije karakteristično povećanje aktivnosti tranaminaza.

Gama-glutamil transpeptidaza (GGT, GGTP, -GT) sadržana je u citoplazmi (izoforma niske molekularne težine) i povezana je s membranama bilijarnog pola (izoforma visoke molekularne težine). Povećanje njegove aktivnosti može biti povezano s citolizom, kolestazom, alkoholom ili intoksikacijom lijeka, rastom tumora, stoga povećanje GGT aktivnosti nije specifično za određenu bolest, nego u određenoj mjeri univerzalno ili skrining za bolesti jetre, iako uključuje dodatna pretraživanja uzroka bolesti.

Laktat dehidrogenaza (LDH) raste s mnogim bolestima. Dijagnostička vrijednost ukupne aktivnosti je mala i ograničena je na definiciju isključivanja tumorskih i hemolitičkih procesa, kao i na diferencijalnu dijagnozu Gilbertovog sindroma (normalno) i kronične hemolize (povećana). Za dijagnosticiranje bolesti jetre značajnija procjena hepatičkog izoenzima LDH - LDH₅.

Povećanje aktivnosti jednog ili svih enzima ukazuje na akutnu bolest jetre, pogoršanje kronične bolesti ili tumorski proces, ali ne ukazuje na prirodu bolesti i ne dopušta postavljanje dijagnoze.
2. Kolestatski sindrom (kolestaza) karakterizira povreda sekrecije žuči. Neki autori identificiraju rijetki anikterni oblik kolestaze povezan s promjenama u normalnim omjerima komponenti žuči (hormonalne promjene, poremećaji enterohepatičke cirkulacije kolesterola). Razlikuju se intrahepatična kolestaza povezana s oslabljenom sekrecijom žuči hepatocitima ili žučnom žučom u žučnim kanalima i ekstrahepatičnom holestazom zbog opstrukcije žučnih puteva s kamenom, tumorom ili davanjem lijekova koji uzrokuju kolestazu. Kod kolestaze supstance koje se izlučuju u žuči kod zdravih ljudi ulaze i akumuliraju se u krvnoj plazmi, a aktivnost takozvanih enzimskih indikatora kolestaze se povećava. Tipičan ikterički oblik kolestaze karakterizira pruritus i žutica.

Kolestaza povećava sadržaj žučnih kiselina; bilirubin s prevladavajućim povećanjem konjugiranog dijela žuči (kolebilirubin); kolesterol i lip-lipoproteini; enzimska aktivnost alkalna fosfataza, GGT, 5-nukleotidaza.

Alkalna fosfataza (alkalna fosfataza) pokazuje svoju aktivnost pri pH 9-10, nalazi se u jetri, crijevima, koštanom tkivu, ali glavni organ za izlučivanje je jetra. U hepatocitima je alkalna fosfataza povezana s membranama žučnog pola i epitelnim mikrovilijama žučnih vodova. Uzroci hiperfermentemije su odgođena eliminacija enzima u žuči i indukcija sinteze enzima, ovisno o bloku enterohepatičke cirkulacije. Povećana aktivnost kod bolesti jetre najčešće ukazuje na kolestazu, pri čemu se aktivnost enzima povećava za 4-10 dana do 3 ili više puta, kao i tumori jetre. S povećanjem aktivnosti alkalne fosfataze trebala bi postojati diferencijalna dijagnoza kod bolesti kostiju.

5-nukleotidaze spada u skupinu alkalnih fosfataza, varira paralelno s njima, ali povećanje njegove aktivnosti povezano je isključivo s kolestazom. Međutim, nedostatak raspoloživih komercijalnih kompleta ne dopušta korištenje ovog pokazatelja u cijelosti.

GGT On je također membranski vezan enzim, a kod holestaze se povećava zbog aktivacije sinteze. Proučavanje GGT-a s kolestazom smatra se obveznim.

Poremećaj izlučivanja žuči dovodi do oslabljene emulzifikacije masti i smanjenja apsorpcije masno-topivih tvari u crijevima, uključujući vitamin K. Smanjenje količine vitamina K u tijelu dovodi do smanjenja sinteze faktora koagulacije ovisnih o vitaminu K i smanjenju protrombinskog indeksa. (PTI). Kod intramuskularne primjene vitamina K s kolestazom PI se u jednom danu povećava za 30%.

3. Hepatodepresivni sindrom uključuje svaku disfunkciju jetre, koja nije praćena encefalopatijom. Sindrom se javlja kod mnogih bolesti jetre, ali je najizraženiji u kroničnim procesima. Da bi se označio sindrom, koriste se testovi otpornosti na stres i određivanje koncentracije ili aktivnosti različitih komponenti seruma ili plazme.

Stres testovi su osjetljivi, ali se rijetko koriste. To uključuje:

a) testovi na izlučnu funkciju jetre - bromsulfalein, indocyanova, itd.;

b) testove za detoksifikaciju jetre - antipirin, kofein, brzi uzorak.

Istraživanja su pokazala da je sintetska funkcija najmanje stabilna za bolesti jetre, a sinteza tih tvari, koje se uglavnom formiraju u jetri, smanjuje se prije svega. Dostupni su i informativni pokazatelji hepatodekrecije:

1. Albumin gotovo potpuno sintetizirana u jetri. Smanjenje njegove koncentracije zabilježeno je kod polovice bolesnika s akutnim i 80-90% bolesnika s CAH i cirozom jetre. Hipoalbuminemija se razvija postupno, što može rezultirati smanjenjem onkotičnog krvnog tlaka i edema, kao i smanjenjem vezanja hidrofobnih i amfifilnih spojeva endogene i egzogene prirode (bilirubin, slobodne masne kiseline, lijekovi, itd.), Što može izazvati pojavu trovanja. Informativno paralelno određivanje albumina i ukupnog proteina. U pravilu, ukupni sadržaj proteina ostaje normalan ili se povećava zbog imunoglobulina (Ig) na pozadini smanjenja koncentracije albumina. Smanjenje albumina na 30 g / l ili manje ukazuje na kronični proces.

2. -1-Antitrypsin - glikoprotein koji čini 80-90% frakcije₁-Globulin, protein akutne faze, sintetiziran u jetri, osjetljiv je pokazatelj upale parenhimskih stanica. Izuzetan dijagnostički značaj povezan je s prirođenim nedostatkom proteina, što dovodi do teških oblika oštećenja jetre i drugih organa kod djece.

3. Kolinesteraza serum (pseudo-kolinesteraza, butirilkolinesteraza - HE, BChE), sintetiziran jetrom, odnosi se na₂-globulina. Jedna od njihovih funkcija je cijepanje mišićnih relaksanata izvedenih iz sukcinil dikolina (listenon, ditilin). Nedostatak enzima ili pojava atipičnih oblika komplicira razgradnju lijekova, što komplicira proces oporavka od anestezije. Da bi se spriječile postoperativne komplikacije, preporuča se odrediti aktivnost enzima i broj dibukaina, tj. stupanj inhibicije enzima dibukaina. Kod kroničnih procesa, osobito ciroze jetre, aktivnost enzima se smanjuje, a stupanj redukcije ima prognostičku vrijednost. Drugi razlog za smanjenje aktivnosti je trovanje organofosfatima.

4. Fibrinogen, Faktor zgrušavanja, protein akutne faze, odnosi se na₂-globulina. Razina fibrinogena prirodno se smanjuje kod teških kroničnih i akutnih bolesti jetre.

5. PTI smanjuje se zbog smanjene sinteze faktora koagulacije ovisnih o vitaminu K (II, VII, IX, X). Za razliku od holestaze, razina IPT-a nije normalizirana intramuskularnom primjenom vitamina K. IPT je marker ozbiljnosti akutne disfunkcije jetre.

6. Kolesterol smanjuje krv u bolesnika s kroničnim hepatitisom i cirozom jetre, češće s subakutnom varijantom tijeka. U masnoj jetri, razina kolesterola može se povećati.

Za kronične bolesti jetre u fazi kompenzacije povećanje enzimske aktivnosti je neuobičajeno. Međutim, umjereno povećanje (za faktor 1,5–3) aktivnosti transaminaza s višom razinom AST ukazuje na oštećenje subcelularnih struktura, osobito MX.

4. Mezenhimsko-upalni sindrom uzrokovan je oštećenjem mezenhima i strome jetre, a to je u biti imunološki odgovor na antigensku stimulaciju crijevnog podrijetla. Ovaj sindrom prati i akutne i kronične bolesti jetre. Markeri sindroma su glob-globulini, imunoglobulini, test timola, antitijela na stanične elemente itd.

definicija -globulina odnosi se na obvezne testove za jetru. Porast glob-globulina, koji su u biti imunoglobulini, karakterističan je za većinu bolesti jetre, ali je najizraženiji kod CAG-a i ciroze jetre. Nedavno se pokazalo da β-globuline mogu proizvesti Kupffer-ove stanice i plazma stanice upalnih infiltrata jetre. Kod ciroze jetre na pozadini niske koncentracije albumina, zbog narušavanja sintetske funkcije jetre, uočava se značajno povećanje α-globulina, dok koncentracija ukupnog proteina može ostati normalna ili povišena.

Imunoglobulini (Ig) su proteini uključeni u glob-globulinsku frakciju i posjeduju svojstva antitijela. Postoji 5 glavnih skupina Ig: IgA, IgM, IgG, IgD, IgE, ali prva tri se koriste za dijagnozu. Kod kroničnih bolesti jetre povećava se sadržaj svih klasa Ig, ali je rast IgM najizraženiji. Kod alkoholnog oštećenja jetre opaža se povećanje IgA.

Timolov test - nespecifična, ali pristupačna metoda istraživanja, čiji rezultat ovisi o sadržaju IgM, IgG i lipoproteina u serumu. Test je pozitivan u 70-80% bolesnika s akutnim virusnim hepatitisom u prvih 5 dana ikteričnog razdoblja, u 70-80% bolesnika s CAH, au 60% s cirozom jetre. Uzorak je normalan u opstruktivnoj žutici kod 95% bolesnika.

Antitijela na tkiva i stanične antigene (nuklearni, glatki mišići, mitohondrijski) omogućuju identifikaciju autoimunih komponenti u bolestima jetre.

Dodatne metode istraživanja uključuju definiciju haptoglobina, orozomukoida,₂-makroglobulin,₂-mikroglobulin, hidroksiprolin, uronske kiseline.
Tablica 1.

Biokemijska dijagnostika bolesti

Biokemijska dijagnostika Biokemijska dijagnostika (klinička kemija (biokemija), patokemija) - smjer kliničke laboratorijske dijagnostike, čiji je cilj praćenje stanja bolesnika i dijagnosticiranje bolesti identificiranjem kemijskih komponenti u biomaterijalu (krv, urin, u nekim slučajevima feces, pleural ili cerebrospinalna tekućina),

Krvna plazma je organizam tekućina koja ima složen kemijski sastav, uključujući veliku količinu anorganskih iona, enzima, hormona, proteina, lipida i ugljikohidrata, kao i otopljeni plinovi - ugljični dioksid i kisik. Koncentracija svih komponenti krvi u zdravoj osobi je unutar određenih granica, što odražava normalno funkcionalno stanje i organizma u cjelini i svake njegove stanice odvojeno. U slučaju različitih bolesti dolazi do narušavanja funkcija organa i sustava, što dovodi do neravnoteže i koncentracije jedne ili više komponenti krvi. Kemijska analiza krvi u procesu dijagnoze temelji se na tom principu. Popis patoloških stanja u kojima je potrebna biokemijska analiza krvi i urina prilično je široka i uključuje bolesti kardiovaskularnog, endokrinog, respiratornog, izlučnog i drugih sustava. Bolesti koje su posljedica pothranjenosti također se dijagnosticiraju pomoću biokemijskih testova krvi. Alimentarni nedostaci mogu se otkriti laboratorijskim dijagnostičkim metodama.

Neke vrste tumorskih stanica mogu se u krvotok osloboditi i specifičnih tvari. Uloga biokemijskih laboratorija u praćenju i dijagnosticiranju raka ograničena je na mjerenje razine tih “tumorskih markera” u krvi.

Sigurnost i učinkovitost terapije lijekovima ovisi o mjerenju koncentracije lijekova u krvi. A to je samo jedan aspekt ogromne uloge biokemijske dijagnostike u praćenju terapije bolesnika.

Danas se većina testova krvi i urina provodi uz pomoć modernih visokotehnoloških automatiziranih dijagnostičkih sustava, čiji biokemijski analizatori omogućuju obavljanje do 1000 testova u 1 satu, do 20 ili više na svakom uzorku. A rezultat dijagnoze većine testova dolazi u roku od 12-24 sata. Većina laboratorija obavlja određeni popis testova cijelo vrijeme, jer s hitnom dijagnostikom rezultati ispitivanja moraju biti spremni u roku od jednog sata.

TAT (ili brzina laboratorijske dijagnostike) je vrijeme od trenutka dodjele testa do vremena kada je rezultat testa primljen ili od trenutka kada se materijal uzima do vremena primitka rezultata ispitivanja. TAT treba odgovarati brzini razvoja patološkog procesa, kao i mogućnostima farmakološke ili druge korekcije.

Nekim pacijentima u odjelima, jedinicama intenzivne njege i jedinicama intenzivne njege često je potrebno stalno praćenje određenih krvnih parametara. Pod tim uvjetima medicinska sestra ovog odjela može obaviti određeni ograničeni popis testova koristeći potrebnu opremu koja se nalazi u odjelu.

POGLAVLJE 4 BIOKEMIJSKA DIJAGNOSTIKA PATOLOŠKIH PROCESA I HEREDITARNIH BOLESTI

4.1. KARDIOVASKULARNA PATOLOGIJA

U području kardiovaskularne patologije, klinička biokemija postigla je najveći uspjeh u dijagnostici infarkta miokarda. Metode kliničke enzimologije i imunokemije omogućuju dijagnosticiranje infarkta miokarda u prvim satima njegovog nastanka, utvrđivanje kliničkog stanja nestabilne angine, diferencijalna dijagnoza teške angine (ishemija) i smrti miocita (anoksija), za procjenu učinkovitosti trombolitičke terapije i reperfuzijske pojave.

U skladu s preporukama Svjetske zdravstvene organizacije, dijagnoza infarkta miokarda temelji se na tipičnoj kliničkoj slici napadaja boli u prsima; EKG promjene; povećanje krvne aktivnosti kardiospecifičnih enzima (markera).

Istodobno, kod ponovljenog infarkta miokarda, kardioskleroze i atrijske fibrilacije, kao iu prisutnosti pejsmejkera (pacemaker) kod pacijenta, mnogo je teže dijagnosticirati infarkt miokarda prema ECG podacima. Osim toga, više od 25% bolesnika kod kojih je potvrđen infarkt miokarda na autopsiji nije imalo ECG promjene. Prema prospektivnoj studiji provedenoj u SAD-u, dijagnoza infarkta miokarda bez proučavanja kardiospecifičnih markera smrti miocita može se napraviti samo u 25% slučajeva.

Među pacijentima koji su u bolnicu za intenzivnu njegu dobili srčanu bol, samo 10-15% ima infarkt miokarda. Potreba za dijagnosticiranjem infarkta miokarda u ranim stadijima diktirana je činjenicom da trombolitička terapija u prvih 2-6 sati smanjuje ranu smrtnost u prosjeku za 30%, a terapija započinje za 7-12 sati - samo 13%. Trombolitička terapija nakon 13-24 h ne smanjuje smrtnost.

Rana dijagnoza infarkta miokarda omogućuje primjenu i transluminalnu angioplastiku, a učinkovitost konzervativnog liječenja je veća, ako je započela što je prije moguće.

Također je potrebno provesti diferencijalnu dijagnozu infarkta miokarda s nestabilnom anginom, kada rano liječenje može spriječiti infarkt miokarda.

Posljednjih godina, arsenal biokemijskih biljega smrti miocita je dopunjen novim visoko specifičnim testovima koji vam omogućuju dijagnosticiranje infarkta miokarda u prvim satima njegovog pojavljivanja. To su testovi koji se mogu primijeniti u prvoj fazi medicinske skrbi, kao i određivanje kardiospecifičnih izoenzima i proteinskih markera za smrt miocita korištenih u jedinici intenzivne njege u zdravstvenim ustanovama. Istovremeno, uspjeh industrijske tehnologije i ispuštanje dijagnostičkih sustava temeljenih na principu "suhe kemije" omogućuju određivanje specifičnih markera smrti miocita u prvoj fazi medicinske skrbi. Međutim, čak i pod tim uvjetima, dijagnostičke pogreške su moguće ako patofiziologija infarkta miokarda i mehanizmi prijema u krv specifičnih organskih i nespecifičnih proteinskih markera smrti miocita nisu jasno shvaćeni.

Lokalizacija u stanici ima značajan utjecaj na brzinu oslobađanja markera iz oštećenog miocita. Citozolni se enzimi oslobađaju brže od onih koji su strukturirani na unutarstaničnim membranama. Za razliku od citosolnih markera, oslobađanje intracelularnog kontraktilnog aparata je potrebno da bi se postigao intersticijalni prostor strukturno povezanih proteina, što usporava proces pojave markera u krvi; potonji su oslobođeni mitohondrijski enzimi.

U proučavanju srčanih markera infarkta miokarda, potrebno je uzeti u obzir niz odredbi, koje se nazivaju principima dijagnoze infarkta miokarda. One uključuju: 1) vremenske intervale; 2) proučavanje markera oštećenja miokarda u dinamici; 3) organska specifičnost laboratorijske dijagnostike infarkta miokarda; 4) složenu prirodu dijagnoze; 5) pojam "sive zone".

Praktično značajni markeri smrti miocita su katalitička koncentracija u krvi KK, LDH, AST, glikogen fosforilaze (GF), povećanje sadržaja krvi u mioglobinu, miozin lancima, trooninima T. I. koncentracije izoenzima u krvi KK-MB i LDH u krvi₁, imunokemijsko određivanje CK-MB i GF-BB, kao i omjer izoformi CK-MB izoenzima i troponina.

U dijagnostici infarkta miokarda važno je uzeti u obzir vrijeme koje je proteklo od početka angine. To je zbog činjenice da relativno dugo razdoblje prolazi od trenutka smrti miocita do pojave markera u krvi. Odljev iz stanica velikih molekula proteina (CC i LDH) može se pojaviti samo ako je integritet plazma membrane miocita poremećen kao posljedica njihove smrti tijekom anoksije. Manje molekule proteinskih markera (mioglobin, troponin) mogu isteći u maloj količini iz stanica i pod uvjetima produljene hipoksije s izraženim promjenama u membrani miocita, prije uništenja stanica. U prva 4 sata nakon okluzije koronarne arterije u zoni maksimalne ishemije, oko 60% miocita je nekrotizirano; nekroza preostalih 40% javlja se u sljedećih 20 sati.

Idući dalje od membrane miocita, proteinske molekule ulaze u izvanstaničnu tekućinu i teku iz srca samo kroz limfne kanale. To određuje dosta dugo (3-6 sati) od vremena smrti miocita do pojave kardiospecifičnih markera u krvi. Prije svega, u krvi se povećava sadržaj mioglobina, GF-BB i troponina, zatim - KK i kardiospecifičnog izoenzima KK-MB, AST; značajno kasnije povećava aktivnost LDH i srčanog specifičnog izoenzima LDH₁ (Sl. 4.1). Klinička osjetljivost kardiospecifičnih markera uvelike ovisi o vremenu koje je proteklo od smrti miocita. Dakle, za KK-MB, pri otkrivanju krvi u prva 3-4 sata nakon napada angine, klinička osjetljivost (dijagnostička točnost) je samo 25-45% i povećava se na 98% u rasponu od 8-32 sata.

Sl. 4.1. Dinamika enzimske aktivnosti u infarktu miokarda. 1 - MW-2 / MW-1; 2 - MM-3 / MM-1; 3 - KK-MB; 4 - ukupno KK; 5 - LDH₁/ LDG₂

CK daje lažno negativne rezultate u 32% slučajeva, AST - u 49%, mioglobin - u 15%. Aktivnost LDH je pouzdan marker smrti miocita nakon 12 sati od početka napada angine, ali ostaje povišena 10-12 dana. Podaci o aktivnosti kardiospecifičnih markera u manje od 4-6 sati nakon napada angine pektoris mogu dovesti do dijagnostičkih pogrešaka, kada čak i uz opsežne infarkt miokarda markeri smrti miocita nisu toliko informativni. Osim toga, brzina povećanja sadržaja srčanih markera u krvi uvelike ovisi o trajanju ishemije i vremenu rekanalizacije trombozne koronarne arterije i reperfuzije miokarda nakon srčanog udara.

Drugo obilježje otpuštanja markera smrti kardiomiocita u krv je karakteristična dinamika povećanja i smanjenja njihove koncentracije (katalitičke koncentracije). To je određeno konstantnom kontrakcijom miokarda, što prvo vodi do brze eliminacije proteina iz nekrotiziranog područja miokarda, a zatim do potpunog ispiranja markerskih proteina u krvotok. Samo u infarktu miokarda sadržaj markera smrti u kardiomiocitima u krvi raste u rasponu od 8-24 sata, au slučaju nekompliciranog infarkta miokarda postoji slično označena eliminacija markerskih proteina iz krvožilnog sloja. U isto vrijeme, sadržaj svakog od markera "ispisuje" lučnu dinamičku krivulju s različitim vremenskim parametrima. Za većinu markera, područje krivulje daje predodžbu o veličini infarkta miokarda, odražavajući količinu nekrotičnog miokardijalnog tkiva. Aktivnost u krvi CC i CC-MB povećava se već pri smrti 1 g tkiva miokarda.

Jedna studija AST, KK ili LDH ima relativno nisku kliničku specifičnost - 66%, povećanje aktivnosti enzima ili sadržaj proteinskih markera u 3-4 sata povećava organsku specifičnost dijagnoze do 86%, treće mjerenje omogućuje dijagnosticiranje infarkta miokarda pomoću čak i tako malo specifičnog testa. definicija AST. Dinamičko ispitivanje markera smrti miocita omogućuje diferencijalno dijagnosticiranje između infarkta miokarda i hiperfermentemije s masivnom lezijom prugastih mišića. U razdoblju od 8-24 h nakon napada stenokardije, aktivnost enzima je toliko indikativna da ako nema dinamičkog povećanja njihove aktivnosti u krvi, onda nema infarkta miokarda.

Nisu pronađeni apsolutno specifični markeri oštećenja kardiomiocita. Specifičnost organa u dijagnostici uz pomoć QA izoenzima temelji se samo na razlici u postotnom omjeru izoenzima u pojedinim organima i tkivima, a time iu krvnom serumu kada su oštećeni.

Vrijednost QC-MB. Izoenzim KK-MB je specifičan za miokard, ne zato što ne postoji takav izoenzim u drugim tkivima, već zato što je njegova aktivnost u kardiomiocitima 15-42% ukupne aktivnosti QC, dok njegov sadržaj u tkivu skeletnog mišića ne prelazi 4%, i samo u crvenim mišićnim vlaknima koja se polako stežu. Pod tim uvjetima, uz poraz miokarda i skeletnih mišića, aktivnost CC može se povećati u istoj mjeri, ali u postocima će se aktivnost CC-MB značajno razlikovati. Kod infarkta miokarda, sadržaj CK-MB prelazi 6% ukupne aktivnosti CK ili 12 IU / l na temperaturi od 30 ° C.

I u patologiji skeletnih mišića iu smrti kardiomiocita u krvi povećava se aktivnost KK-MB, ali u prvom slučaju njegova aktivnost neće premašiti 6% aktivnosti KK, au drugom slučaju će se povećati na 12-20%. Preporučljivo je istodobno izraziti aktivnost QC-MB u jedinicama od 1 litre (IU / l) i kao postotak aktivnosti QC. Određivanje KK-MB aktivnosti ostaje najpopularniji test u dijagnostici infarkta miokarda. U infarktu miokarda kod starijih bolesnika, aktivnost QC može se samo povećati u maloj mjeri, ali uz značajno povećanje aktivnosti QC-MB. Kod takvih bolesnika dijagnostički je važno istražiti aktivnost CK-MB, čak i uz ne tako značajno povećanje aktivnosti CK.

Tijekom operacija na srcu (srčane mane, operacija koronarne arterije), QC-MB aktivnost se koristi za dijagnosticiranje postoperativnog infarkta miokarda. Odmah nakon operacije, zbog hipoksije i oštećenja miokarda, aktivnost KK-MB u krvi se povećava i vraća u normalu u roku od 10-12 sati, a s razvojem infarkta miokarda KK-MB aktivnost se značajno povećava i ima dinamičku karakteristiku infarkta miokarda.

Vrijednost LDH. LDH aktivnost₁ svojstvo miokarda kao tkiva s anaerobnim tipom razmjene. U uvjetima hipertrofije miokarda i kronične hipoksije sinteza LDH₁ u kardiomiocitima počinje rasti. U infarktu miokarda dolazi do povećanja katalitičke koncentracije LDH u krvi zbog povećanja

sadržaj LDH izoenzima₁ i LDH₂ u omjeru LDH₁/ LDG₂ više od 1. LDH - citosolni enzim; Značajno povećanje aktivnosti LDH u krvi tijekom infarkta miokarda javlja se kasnije nego QC i AST, tijekom 1 dana napada angine; visoka aktivnost LDH₁ traje 12-14 dana. Kao test se koristi smanjenje aktivnosti LDH u krvi u normalu, što ukazuje na završetak perioda resorpcije nekrotiziranog tkiva miokarda. Ako je aktivnost LDH₁, određena izravnom metodom, s inhibicijom subjedinice M antitijelima koja prelazi 100 IU / l, to je pouzdan znak infarkta miokarda.

Za razliku od izoenzima M podjedinice i LDH₃ (MMNN) LDH₄ (HMMM) i LDH₅ (MMMM) podjedinica H i izoenzim LDH₁ (IUUH) u manjoj mjeri LDH₂ (NNNM), kao supstrat mogu koristiti ne samo laktat i piruvat, već i a-hidroksibutirat. To je bio temelj prijedloga za procjenu aktivnosti LDH₁ u krvi, koristeći a-hidroksibutirat kao supstrat; dok je izozim LDH₁ naziva se a-hidroksibutirat dehidrogenaza (a-HBDG). U infarktu miokarda, ispitivanje aktivnosti ukupnog LDH i α-HBDG daje slične rezultate. Ako se aktivnost LDH u krvi poveća kao rezultat drugog patološkog procesa, aktivnost LDH bit će značajno viša od aktivnosti LDH.₁ i α-HBDG u odsutnosti dinamike karakteristične za infarkt miokarda.

U infarktu miokarda nije bilo značajne korelacije između KK-MB i LDH aktivnosti.₁ u svim pojmovima infarkta, koji se javlja kao rezultat značajne razlike u dinamici i vremenu povećanja aktivnosti ovih izoenzima u krvi.

Molekule enzima koje su ušle u krv nakon smrti kardiomiocita su patološke komponente krvne plazme i stoga ih treba ukloniti. Ovisno o veličini molekula markera, neki proteini, kao što je mioglobin, izlučuju se u urin ili fagocitne stanice monocitno-makrofagnog sustava. Međutim, prije nego što CK-MB i CK-MM molekule postanu fagocitozirane od strane makrofaga, one prolaze kroz sekvencijalno djelovanje proteaza u krvi, što rezultira stvaranjem CK-MB i CK-MM izoenzima.

U miocitima, KK-MM izoenzim predstavlja jedan oblik MM-3. U krvi karboksipeptidaza sekvencijalno cijepa konačne aminokiselinske ostatke lizina iz svakog od dva monomera, sukcesivno formirajući izoforme MM-2 i MM-1. Određivanje KK-MM i KK-MB izoformi metodom EF i izračunom njihovog omjera

dopustiti do 1 sat da se utvrdi vrijeme smrti kardiomiocita. Omjer MM i MB izoforma mijenja se prije povećanja aktivnosti KK-MB.

Enzimodijagnoza infarkta miokarda u kliničkim dijagnostičkim laboratorijima je složena. Prvo odrediti aktivnost AST, KK i LDH, zatim istražiti aktivnost KK-MB i LDH₁. Integrirani pristup dijagnostici enzima posljedica je, prvo, činjenice da se pri proučavanju aktivnosti jednog enzima može napraviti pogreška; drugo, svaki od ovih enzima razlikuje se dijagnostičkim značenjem i dinamikom (vrijeme pojave u krvi i brzina eliminacije iz krvožilnog sloja). Osim netočnosti koje se mogu napraviti na predanalitičkom (uzorkovanje krvi za analizu) i analitičkim fazama, postoje objektivni razlozi koji utječu na rezultate određivanja aktivnosti enzima. Poteškoće nastaju kada se infarkt miokarda razvije u pozadini teških somatskih bolesti, s infarktom miokarda kompliciranim kardiogenim šokom, s septikemijom.

Unatoč kliničkoj specifičnosti djelovanja QC za infarkt miokarda (98%), u nekim slučajevima, povećanje aktivnosti QC i QC-MB nije moguće otkriti ni u uvjetima provjere dijagnoze infarkta miokarda prema EKG podacima. To se događa u slučajevima kada se infarkt razvija na pozadini zatajenja bubrega i nakupljanja uremičkih toksina (srednje molekularnih peptida), u bolesnika s cirozom jetre i manjkavom detoksikacijskom aktivnošću hepatocita, s septikemijom i endogenom intoksikacijom, s izraženom metaboličkom (ili respiratornom) acidozom. Pod tim uvjetima, tako velik broj ne-specifičnih inhibitora akumulira se u krvi da je aktivnost QC i QC-MB praktički neodređena. U takvim slučajevima, aktivnost QC je moguće odrediti tek nakon postupka razrjeđivanja seruma nepopularnog u kliničkoj biokemiji, kada smanjenje koncentracije inhibitora dopušta pojavu aktivnosti enzima.

Prisutnost inhibitora KK i KK-MB u krvi potaknula je razvoj imunokemijske metode za određivanje u krvi ne katalitičke aktivnosti, već sadržaja KK-MB molekularnom težinom ovog oblika. To je značajno poboljšalo osjetljivost metode i ponovljivost rezultata. Iako s nekompliciranim infarktom miokarda, aktivnost KK-MB i sadržaj KK-MB proteina koreliraju dobro,

moguće je odrediti sadržaj QC-MB u krvi nekoliko sati ranije nego što je enzim aktivan. Značajno povećanje razine CK-MB proteina u krvi zabilježeno je kod polovice bolesnika već nakon 3 sata, a 6 sati nakon napada angine pektoris, visoka razina proteina zabilježena je u svih bolesnika s kliničkom slikom infarkta miokarda. Već 90 minuta nakon trombolize, razina KK-MB proteina u krvi se povećava nekoliko puta. U bolesnika s nestabilnom anginom češće se bilježi povećanje sadržaja KK-MB proteina nego povećanje aktivnosti izoenzima. Istovremeno, unatoč proizvodnji dijagnostičkih paketa od strane različitih tvrtki, pitanje standardizacije metode za određivanje broja QC-VM nije konačno riješeno.

Vrijednost glikogen fosforilaze. Od markera enzima i izozima u dijagnostici infarkta miokarda, klinički biokemičari određuju aktivnost GF-a i njegovog izoenzima GF-BB. GF je citosolni enzim koji katalizira uklanjanje glukoze iz glikogena u stanici.

U ljudskim tkivima postoje tri GF izoenzima: GF-LL u jetri, GF-MM u miocitima i GF-BB u moždanom tkivu. U ljudskom miokardiju postoje GF-BB i GF-MM izoenzimi, u miocitima skeletnih mišića - samo GF-MM. GF-BB je najosjetljiviji test za dijagnozu infarkta miokarda u prva 3-4 sata nakon napada angine. Prema dijagnostičkoj osjetljivosti u prvim satima, određivanje GF aktivnosti može se usporediti samo s određivanjem mase KK-MB u krvi. Kod većine bolesnika razina GF-BB značajno je porasla već nakon 4 h nakon napada angine, a nekomplicirani infarkt miokarda vratio se na normalu unutar 48 sati.

Vrijednost mioglobina. Među proteinskim markerima infarkta miokarda, najčešće korištena definicija u krvi je sadržaj mioglobina (MG). MG je kromoprotein, koji u citosolu svih mišićnih stanica prenosi kisik uglavnom u mitohondrije. Molekulska masa MG je samo 18 kD; njegova svojstva su slična u miocitima skeletnih mišića i kardiomiocitima. MG je stalno prisutan u krvnoj plazmi u koncentraciji ispod 80 ng / ml. Kod infarkta miokarda, razina MG u krvi raste 10-20 puta.

• Povećani MG u krvi - najraniji test za dijagnozu infarkta miokarda; povećanje razine MG u krvi može se odrediti nakon 3-4 sata nakon napada angine. To je prva dijagnostička vrijednost MG.

• Drugo obilježje MG u dijagnostici infarkta miokarda je da takva mala molekula slobodno prolazi kroz filtracijsku barijeru bubrežnih tijela i brzo završava u mokraći. To određuje prirodu promjena u sadržaju MG u krvi: brzo se povećava i smanjuje jednako brzo. Samo pri određivanju MG moguće je dijagnosticirati recidivirajuće infarkt miokarda (slika 4.2), koji se razvijaju nekoliko sati nakon prve epizode smrti kardiomiocita. Osim toga, u brojnim kliničkim opažanjima uočena su značajna kolebanja razine MG u krvi prvog dana infarkta miokarda, kada je značajno povećanje u nekoliko sati ustupilo mjesto jednako izraženom smanjenju. Situations U nekim situacijama razina MG u krvi ostaje dugo vremena stalno visoka. To se uočava u kardiogenom šoku, kada smanjenje kontraktilne funkcije dovodi do hipotenzije, pada hidrostatskog tlaka preko bubrežne membrane i prekida

Sl. 4.2. Dinamika koncentracije mioglobina u krvi nakon ponovljenog napada angine pektoris

glomerularna filtracija, kada se MG ne može filtrirati u urin. Istovremeno, postoji pozitivna korelacija između sadržaja MG u krvi pozitivno korelira s povećanjem razine kreatinina.

Glavna strukturna kontraktilna jedinica miocita je sarcomere, koji se formira uredno raspoređenim debelim i tankim vlaknima. Tanka vlakna sadrže aktin i troponin-tropomiozinski kompleks.

Vrijednost troponina. Regulacijski kompleks troponina u striatnim mišićima sastoji se od tri polipeptida; U dijagnostici infarkta miokarda određen je sadržaj samo troponina T (Tn T) i troponina I (Tn I) u krvi. Svaki protein ima tri izoforme, čiju sintezu kodiraju tri različita gena. Izoforme miokarda Tn T i Tn I (srce Tn T i srce Tn I) koriste se kao specifični markeri smrti kardiomiocita.

Određivanje sadržaja Tn T omogućuje dijagnozu infarkta u ranom i kasnijem razdoblju. Sadržaj Tn T u krvi raste nakon nekoliko sati nakon napada angine. U ranim stadijima infarkta miokarda, klinička osjetljivost određivanja mioglobina i sadržaja KK-MB viša je od Tn T, ali od trećeg dana razina Tn doseže plato, koji traje postupno smanjivanje za 5-6 dana. Razina Tn pokazala se visokom u onim razdobljima nekompliciranog infarkta miokarda, kada se razina aktivnosti mioglobina i KK-MB već vratila u normalu, a samo visoka aktivnost LDH ostaje u krvi.₁. U nekim slučajevima, pri određivanju TnT, dijagnoza infarkta miokarda može se napraviti kasnije - 8-10 dana nakon anginalne boli. Posebno je važno istražiti TI u bolesnika koji su primljeni u bolnicu 2-3 dana nakon napada angine, kada se KK i KK-MB indikatori već mogu vratiti na svoju izvornu normalnu razinu. Osim toga, u usporedbi s KK i KK-MB, sadržaj Tn T u krvi se povećava u većoj mjeri, što karakterizira višu dijagnostičku osjetljivost određivanja sadržaja Tn T krvi.

Usporedna studija Tn T i Tn I pokazala je veću dijagnostičku osjetljivost Tn I. Stoga, razina Tn I u krvi tijekom infarkta miokarda može biti gotovo 100 puta veća od gornje granice normale. Uz mali infarkt miokarda, razina Tn I u krvi raste u većoj mjeri nego aktivnost CC,

Tablica 4.1. Usporedna svojstva markera srčanog seruma

Postotak ili omjer QC-MB / ukupno. QC 6 Vrijeme od početka bolnog napada ovisi o metodi

KK-MB i LDG₁. Određivanje oba oblika Tn T i Tn I poželjnije je u dijagnostici infarkta miokarda, koji se razvija u postoperativnom razdoblju i nakon mjera aktivne reanimacije.

Ne postoji idealan marker statusa kardiomiocita (Tablica 4.1). U dijagnostici infarkta miokarda, klinički biokemičari imaju tendenciju da koriste većinu organski specifičnih izoenzima i identificiraju proteinske markere koji sadrže samo stanice miokarda. Međutim, za dijagnozu infarkta miokarda u laboratorijima nastavljaju se određivati i MG. Međutim, s nekompliciranim infarktom miokarda, dinamika nespecifičnog MG-a u krvi praktički ponavlja onu kod kardio-specifičnog CK-MB, što je za 4-6 sati ispred nje, a pokušaji da se odredi sadržaj MG u mokraći za dijagnozu infarkta miokarda nisu uspješni.

4.2. BOLESTI ŽIVOTA

Unatoč mnogim biokemijskim procesima koji se odvijaju u stanicama jetre, nisu svi oni dijagnostički vrijedni. Razlog tome su ograničene metodološke sposobnosti laboratorija, niska razina znanja o patofiziologiji jetre, kao i jednosmjerne promjene u brojnim biokemijskim testovima.

Dominantna vrijednost u laboratorijskoj dijagnozi bolesti jetre je određivanje enzimske aktivnosti. Enzimi sintetizirani hepatocitima i epitelnim stanicama žučnih kanala mogu se podijeliti na indikatorske, sekretorne i izlučne. Izlučujući enzimi uključuju kolesterazu, njegova aktivnost u krvi kod bolesti jetre se smanjuje zbog kršenja njegove sinteze. Enzimi za izlučivanje uključuju alkalnu fosfatazu, GGT i PAWS. Najveća skupina dijagnostički važnih enzima su indikatorski enzimi, uključujući ALT, AST, LDH i GLDH. U kartici. Slika 4.2 prikazuje naznačene enzime i njihovu unutarstaničnu distribuciju.

Široko rasprostranjena u diferencijalnoj dijagnozi bolesti jetre primila je metodu uspoređivanja stupnja povećanja aktivnosti enzima s različitom lokalizacijom u hepatocitima i odražava različite strane funkcionalne aktivnosti staničnih lezija. Najčešće korišteni omjer enzima prikazan je u tablici. 4.3.

Tablica 4.2. Enzimi jetre

Tablica 4.3. Omjer jetrenih enzima

Kod bolesti jetre koristite koeficijent De Ritis (omjer aktivnosti AST / ALT). AST / ALT omjer više od 2 je tipičan za lezije izazvane alkoholom, a manje od 1 za virusni hepatitis i kolestatski sindrom. U većini slučajeva virusnog hepatitisa, omjer AST / ALT ostao je ispod 1. Kod virusnog hepatitisa aktivnost ALT se povećava deset puta. U akutnom alkoholnom hepatitisu aktivnost AST je viša od ALT, dok aktivnost oba enzima ne prelazi 500-600 IU / L. Bolesnici s toksičnim hepatitisom, infektivnom mononukleozom, intrahepatičnom holestazom, cirozom, jetrenim metastazama, aktivnostima AST infarkta miokarda veći je od aktivnosti ALT. Aktivnost ALT i AST se povećava kod uzimanja eritromicina, para-aminosalicilne kiseline, dijabetičke ketoacidoze, psorijaze, a koristi se i za ranu dijagnozu anikteričnog hepatitisa.

U diferencijalnoj dijagnozi patologije jetre važno je istražiti omjere aktivnosti izoenzima LDH. Povećanje relativne aktivnosti izoenzima LDH₅ karakteristične za lezije hepatocita. LDH hiperfermentemija je promatrana u različitim stupnjevima u akutnom virusnom, lijekovnom i hipoksičnom hepatitisu, zatajenju srca, cirozi jetre i ekstrahepatičnoj holestazi, kao i smanjenju osmotske rezistencije eritrocita i hemolize. Dugotrajno povećanje aktivnosti izoenzima LDH₅ i LDH₄ ukazuje na prisutnost metastaza u jetri.

Trenutno, u dijagnostici bolesti jetre, stabilnost koloidnih sustava još se procjenjuje pomoću timolnih i sublimatnih testova. Patološki rezultati odražavaju rana razdoblja akutnog hepatitisa, toksično oštećenje jetre, pogoršanje kroničnog hepatitisa. ESP proteini u krvnom serumu također pružaju nespecifične podatke, ali omogućuju procjenu prirode patološkog procesa. Postotak albumina, proteina akutne faze i γ-globulina pomaže u dijagnostici patologije jetre: nizak albumin i visoka razina γ-globulina karakteristični su za cirozu jetre. Povećana razina γ-globulina u krvi također se nalazi u masnoj infiltraciji jetre, upalama žučnih putova i malignitetu.

Sadržaj albumina u serumu ima dijagnostičku vrijednost u akutnim i kroničnim oblicima hepatitisa. U svim slučajevima akutnog hepatitisa razina albumina u krvi ostaje normalna.

Kronični hepatitis prati hipoalbuminemija i hipergamaglobulinemija.

Jetra je središnja karika u regulaciji zgrušavanja krvi. Hepatociti sintetiziraju fibrinogen, mnoge aktivatore i inhibitore kaskade enzimatskih reakcija. I akutni i kronični hepatitis ometaju ovu regulaciju. Dijagnostički testovi na bolesti jetre uključuju produljenje protrombinskog vremena, akumulaciju u krvi produkata uništenja fibrinogena. Akutno oštećenje jetre popraćeno je povećanim krvarenjem u uvjetima hipofibrinogenemije.

Poremećaj funkcije jetre popraćen je promjenom metabolizma LP-a. Hipertrigliceridemija je karakteristična za različite oblike patologije jetre. Hiperholesterolemija se često javlja kada su žučni kanali blokirani i opstruktivna žutica. Kod kroničnog hepatitisa, slobodni kolesterol se nakuplja u krvi kao rezultat smanjenja njegove esterifikacije u krvotoku. U uvjetima izražene kolestaze uočava se nastanak kolestatskog makroskopskog oblika LP - LP - X, koji tvori kompleks LP s fragmentom plazmatske membrane.

U većini slučajeva bolesti jetre etiološki faktor ostaje izvan dosega dijagnoze, a klinički biokemičari postavljaju dijagnozu na temelju principa sindromske dijagnoze.

Glavni patološki procesi koji čine laboratorijsku dijagnozu bolesti su sljedeći sindromi:

• intrahepatična i ekstrahepatična kolestaza;

• toksične lezije hepatocita;

• nedostatak sintetskih procesa u hepatocitima;

• usporavanje inaktivacije toksičnih spojeva;

Sindrom citolize. Patofiziološka osnova sindroma citolize je povreda integriteta plazmatske membrane hepatocita i njihovih organela s razvojem hiperfermentemije. Teška hiperfermentemija kada citosolni enzimi uđu u krvotok karakteristična je za infektivni hepatitis, medicinsko i toksično oštećenje jetre, trovanje, dekompenziranu cirozu i perifokalnu upalu parenhima u kolangitisu. U enzimodijagnostici citoliznog sindroma dominira definicija

ALT, AST i LDH aktivnosti. Normalno, aktivnost ALT i AST u krvi ne prelazi 24 IU / l; unutar 100 IU / L, hiperfermentemija se smatra “sivom zonom”, koja može biti posljedica reaktivnih promjena u hepatocitima. Aktivnost ALT iznad 100 IU / l ukazuje na oštećenje parenhima jetre. Povećanje aktivnosti ALT u 100-200 puta (do 2-6 tisuća IU / l) odražava veliko oštećenje hepatocita u virusnom hepatitisu i trovanje organskim otapalima.

Sindrom intrahepatične i ekstrahepatične kolestaze. Intrahepatic cholestasis sindrom određuje kršenje odljeva žuči iz jetre. Povećanje volumena hepatocita dovodi do kompresije žučnih putova, narušene funkcije drenaže. Obturacija velikih žučnih kanala je uzrok ekstrahepatične kolestaze; najizraženija kolestaza s opstruktivnom žuticom. U kartici. 4.4. Prikazuje kombinaciju laboratorijskih testova koji se najčešće koriste za diferencijalnu dijagnozu kolestaze.

Tablica 4.4. Dijagnoza kolestaze

Pouzdani markeri intrahepatičnog sindroma kolestaze su povećanje aktivnosti ALP, GGT i 5-nukleotidaze u krvi. U epitelnoj membrani žučnog kanala, enzimi su smješteni blizu jedan drugome, pa se s uništenjem membrana njihova aktivnost u krvotoku povećava istovremeno i jednako.

Reaktivne promjene u epitelu bilijarnog trakta i plazmatskih membrana hepatocita procjenjuju se na temelju aktivnosti alkalne fosfataze. Aktivnost alkalne fosfataze pomaže u diferencijalnoj dijagnozi intrahepatične i ekstrahepatične kolestaze. Tijekom ekstrahepatične opstrukcije (kamenje žučnih putova, neoplazma Vater-papile), alkalna aktivnost fosfora povećava se 10 puta ili više. Intrahepatičnu opstrukciju u parenhimskim lezijama (hepatitis) prati

je povećanje aktivnosti alkalne fosfataze za 2-3 puta. Akutna nekroza hepatocita ne može biti popraćena povećanjem aktivnosti alkalne fosfataze ako to ne uzrokuje kompresiju žučnih putova (intrahepatična kolestaza). Nisu svi patološki procesi u jetri promatrali ovisnost između aktivnosti alkalne fosfataze i hiperbilirubinemije. U ranim stadijima intrahepatične kolestaze povećanje aktivnosti alkalne fosfataze posljedica je aktivacije njegove sinteze; nadalje, njegovo povećanje povezano je s uništenjem žučnih kanalika pod djelovanjem žučnih kiselina.

Sindrom intracelularne kolestaze. Povećanje veličine hepatocita i njihova kompresija žučnih putova između segmenata jetre dovodi do pojave intracelularnog sindroma kolestaze s umjerenim povećanjem aktivnosti alkalne fosfataze i GGT u krvi, te oštećenja epitela žučnih putova. Povećanje sadržaja žučne kiseline u krvi također je rani simptom kolestaze.

Čest simptom bolesti jetre praćen kolestazom je nakupljanje bilirubina u krvi. Težina hiperbilirubinemije je nepouzdana za diferencijalnu dijagnozu intrahepatične i ekstrahepatične kolestaze. Istovremeno, hiperbilirubinemija ima prognostičku vrijednost. Povećanje razine bilirubina je pet puta tipično za intrahepatičnu kolestazu, a povećanje koncentracije bilirubina je 10 puta više karakteristično za akutni hepatitis.

Sindrom toksičnog oštećenja hepatocita razvija se, na primjer, tijekom alkoholiziranosti, kada su odsutni učinci citolize, ali alkohol krši funkciju mitohondrija.

U akutnoj alkoholnoj intoksikaciji razvija se sindrom toksičnog oštećenja subcelularnih formacija, a integritet plazmatskih membrana u hepatocitima nije ugrožen. Metaboliti alkohola imaju toksični učinak, osobito acetaldehid, koji se formira izravno u mitohondrijima. U isto vrijeme, u stanici se smanjuje stvaranje visokoenergetskih spojeva, osobito ATP, što ima patološki učinak na procese detoksikacije otrovnih spojeva. U akutnom razdoblju alkoholnog hepatitisa aktivnost AST može dominirati u krvi zbog visoke aktivnosti mitohondrijskog izoenzima AST, a ne citoplazmatske.

Uključivanje hepatocita u patološki proces mitohondrija popraćeno je pojavom GlDG aktivnosti u krvi. Povećana aktivnost GlDG je rani test na alkoholni hepatitis, ali 8-10-struko povećanje aktivnosti GlDG s umjerenom aktivacijom AST i ALT karakteristično je za opstruktivnu žuticu. Za otrovne

djelovanje alkohola karakterizira naglašeno povećanje aktivnosti GGT u krvi bez značajnog povećanja aktivnosti alkalne fosfataze.

Sindromski nedostatak sintetskih procesa očituje se u smanjenju sinteze transportnih proteina hepatocita, proteina koagulacijskog sustava krvi, CE.

HE i njegovi izoenzimi sintetiziraju hepatocite. U uvjetima parenhimske lezije sinteza ChE i njegova aktivnost u krvi se smanjuje. Češće dolazi do smanjenja CE u krvi kao posljedice toksičnih učinaka (citostatika, insekticidi, fungicidi, fluoridi). Fiziološki pad aktivnosti ChE događa se tijekom trudnoće. Zabilježeni su rijetki slučajevi genetički određenog smanjenja sinteze ChE.

Kod akutnog zatajenja jetre, hipoglikemija se razvija kod svakog 4. pacijenta. U uvjetima akumulacije intermedijernih metabolita i razvoja inzulinske rezistencije, moguća je i pojava hiperglikemije. Kod dugotrajnog zatajenja jetre javlja se hiperinzulinemija (smanjenje razaranja hormona u jetri). U uvjetima hipoksije i aktivacije anaerobne glikolize nastaje metabolička acidoza s nakupljanjem mliječne kiseline u krvi (laktatna acidoza). Metabolička acidoza dovodi do povrede omjera elektrolita. Poraz parenhima jetre popraćen je smanjenjem stvaranja kreatinina i ureje. Naravno da tome pridonose neadekvatni unos proteina i probavni poremećaji. Međutim, glavni uzrok hipokreatinemije je smanjenje sinteze kreatinina u hepatocitima. U bolesnika s hepatitisom hipokreatinemija povezana je sa smanjenjem razine mokraćne kiseline u krvi.

Sindrom usporavanja inaktivacije toksičnih spojeva posljedica je inhibicije njihove hidroksilacije u mikrosomalnom aparatu hepatocita, što smanjuje brzinu inaktivacije mnogih lijekova u tijelu. U tim uvjetima, čak i niska terapijska doza lijeka može uzrokovati izraženu nuspojavu.

Jetra služi kao biološka barijera endogenih i egzogenih toksičnih spojeva, koji prvenstveno dolaze iz gastrointestinalnog trakta. Procjena detoksikacijske funkcije jetre se češće provodi s kroničnim lezijama pomoću testova otpornosti na stres s galaktozom, fenol-tetrabromoftalen-sulfonskom kiselinom, bromocijanovim zelenim, označenim spojevima. Testovi opterećenja pružaju priliku za dijagnosticiranje kroničnih oblika bolesti, za procjenu

rezidualni učinci prenesenog hepatitisa, kako bi se stvorila ideja o funkciji jetre u cirozi, masnoj infiltraciji jetre.

U teškim situacijama jetrene kome s akutnim virusnim hepatitisom ili portalnom hipertenzijom, procjenjuje se detoksikacijska funkcija jetre na temelju količine amonijaka u krvi. Nastajanje amonijaka u crijevima konstantno se javlja kao rezultat vitalne aktivnosti mikroorganizama i deaminacije aminokiselina nastalih iz proteina hrane. Usred masivnog krvarenja iz želuca ili vena jednjaka, dolazi do povećanog stvaranja amonijaka iz albumina u krvi.

Upalni sindrom uzrokovan je aktivacijom RES stanica. Karakterizira ga povećanje sadržaja krvi u proteinima akutne faze, disproteinemija u suprotnosti s omjerom serumskih proteina na elektroforegramu, promjena uzoraka sedimenata (timola), povećanje koncentracije imunoglobulina.

Unatoč raznovrsnosti ovih poremećaja, primjena tehnika sindromske dijagnoze je učinkovita već u ranim fazama bolesti jetre. Naravno, rezultati biokemijskih istraživanja u dijagnostičkom procesu nisu jedinstveni. Istovremeno, kliničari koriste podatke iz anamneze i fizikalnog pregleda, rezultate radionuklidne dijagnostike, kompjutorsku tomografiju i biopsiju jetre. Istovremeno, diferencijalna dijagnostika u ranim stadijima bolesti i procjena naravi oštećenja hepatocita mogu se provesti samo na temelju laboratorijskih ispitivanja, uglavnom podataka iz kliničke biokemije. Korištene kombinacije laboratorijskih ispitivanja prikazane su u tablici. 4.5.

Tablica 4.5. Dijagnostika bolesti jetre pomoću enzima

4.3. PATOLOGIJA KOVINSKE TKIVA

Glavni čimbenici koji reguliraju metabolizam fosfata i kalcija uključuju PTH, kalcitonin i vitamin D. PTH i kalcitonin održavaju stalnost kalcija u vaskularnom sloju i izvanstaničnoj tekućini, utječu na apsorpciju kalcija u crijevima, reapsorpciju u bubrezima, crijevima i taloženje u koštanom tkivu. PTH regulira kalcij u krvi, utječući na apsorpciju kalcija u crijevima i bubrežnim tubulima, mobilizaciju kalcija iz koštanog tkiva. Kalcitonin ima manje značajan učinak, smanjujući aktivnost osteoklasta, povećava aktivnost osteoblasta, što dovodi do smanjenja kalcija u krvi.

PTH je polipeptid, čiji se jedini lanac sastoji od 84 aminokiselinskih ostataka. Hormon luči paratiroidne žlijezde, vjerojatno u obliku neaktivnog prekursora, od kojeg se aktivni hormon formira cijepanjem fragmenta polipeptida. Aktivni PTH ima kratki poluživot, što stvara probleme za analizu: koristeći radioimunološku metodu, uglavnom se mjeri karboksi-terminalni fragment hormona koji ima duži poluživot, ali je biološki neaktivan.

Kada djeluje na bubrege, PTH potiskuje reapsorpciju fosfora u proksimalnim i distalnim tubulama nefrona, povećavajući njezino izlučivanje i, sukladno tome, snižavajući razinu fosfora u krvi (hipofosfatemija). U isto vrijeme, hormon povećava tubularnu reapsorpciju kalcija, osobito u distalnim tubulima nefrona. Djelovanje PTH u koštanom tkivu uzrokuje mobilizaciju kalcija i fosfata, što pridonosi nastanku osteoporoze i hiperkalcemije. Negativna povratna hipokalcemija je glavni poticaj za PTH sekreciju, dok hiperkalcemija potiskuje stvaranje hormona paratiroidnim žlijezdama. PTH također povećava apsorpciju kalcija i fosfora u crijevu, stimulirajući sintezu 1,25-dihidroksiholekalciferola.

U slučajevima hipersekrecije PTH s paratiroidnim adenomom razvija se izražena osteoporoza, uz prisutnost

hiperkalcemija i hipofosfatemija i povećano izlučivanje kalcija i fosfata u urinu. U tim uvjetima inhibirana je reapsorpcija fosfata u tubulima, a time i povećano izlučivanje fosfata, povećava se klirens fosfata s pojavom hiperkalcemije u uvjetima resorpcije kosti s razvojem osteoporoze. Dijagnostiku možete potvrditi određivanjem koncentracije PTH u krvi. U slučajevima kada hipofosfatemiju prati hiperkalcemija, dijagnostički je važno i umjereno povećanje sadržaja hormona.

Treba imati na umu da u nekim oblicima tumora pluća, bubrega, jajnika nastaje ektopična PTH u tumorskim stanicama. Među takvim uvjetima potrebno je razlikovati oblik rahitisa otpornog na vitamin D. Ta nasljedna bolest koja se rijetko javlja povezana sa spolom zove se Fanconijev sindrom. Potonji se odlikuje visokim izlučivanjem fosfora u mokraći istovremeno s glukozurijom i aminoacidurijom bez pojave acidoze u krvi.

Kod kroničnog zatajenja bubrega, aktivacija sinteze PTH može se pojaviti kao kompenzacijski mehanizam u razvoju hipokalcemije i hiperfosfatemije. Sekundarni hiperparatiroidizam je također opažen kod osteomalacije, uzrokovane značajnim smanjenjem apsorpcije kalcija u crijevu s povećanim izlučivanjem.

Ovo se patološko stanje najčešće pojavljuje kao komplikacija operacije na štitnjači, kada se paratireoidne žlijezde uklanjaju greškom. U ovom slučaju, razina kalcija u krvi je tako niska da se razvijaju specifični simptomi hipokalcemije i hiperfosfatemije (simptomi Khvostek i Trusso), izlučivanje kalcija i fosfora s urinom. Ovo stanje zahtijeva trenutnu intravensku primjenu kalcijevog klorida.

U kliničkoj slici pseudo-hipoparatiroidizma, promjena u razinama fosfata i kalcija u krvi slična je primarnoj hipoparatiroidizmu, ali se istovremeno povećava sadržaj PTH u krvi. Ovo stanje

karakteristična za genetsku bolest (Albrightova bolest) povezana s nemogućnošću da tubularne stanice bubrega reagiraju na hormon.

Drugi hormon koji regulira metabolizam fosfora i kalcija je kalcitonin. Jedno-lančani peptid s 32 aminokiselinska ostatka izlučuje parfolikularne stanice lateralnih režnjeva štitne žlijezde. Ovaj hormon inhibira mobilizaciju fosfata i kalcija, dok se njihov sadržaj u krvi smanjuje (hipokalcemija i hipofosfatemija). Učinak hormona na bubrege nije dobro shvaćen; Kalcitonin se predlaže za povećanje tubularnog izlučivanja fosfata. Dodatno, hormon inhibira stimulirajući učinak PTH na sintezu 1,25-dihidroksihaloalkalciferola.

ULOGA VITAMINA D

Treći čimbenik koji aktivno utječe na metabolizam kalcija i fosfora u koštanom tkivu je vitamin D. Sinteza vitamina D u tijelu odvija se u dvije faze hidroksilacije: prva se javlja u jetri u obliku tvari s ograničenom biološkom aktivnošću; drugi stupanj se javlja u bubrezima s formiranjem vitamina D₃, holekalciferol s maksimalnom biološkom aktivnošću. Vitamin D u tankom crijevu₃ stimulira apsorpciju fosfora i kalcija, u proksimalnim dijelovima cjevastog dijela nefrona aktivira reapsorpciju oba iona. Čimbenici koji aktiviraju sintezu vitamina D₃ u bubrezima je smanjenje sadržaja fosfora u krvi i učinak PTH.

U uvjetima nedostatka vitamina D, zbog smanjenja sadržaja njegovih masnih topljivih prekursora u hrani, nedovoljnog ultraljubičastog zračenja kože ili malapsorpcije, u krvi je zabilježena izražena hipofosfatemija. Kao odgovor na povećanje izlučivanja PTH, apsorpcija kalcija i fosfata u tankom crijevu i mobilizacija minerala iz koštanog tkiva se povećavaju. Tijekom vremena to normalizira sadržaj kalcija u krvi, ali koncentracija fosfora može ostati smanjena zbog inhibicije njegove reapsorpcije paratiroidnim hormonom.

U kroničnom zatajenju bubrega razvija se sindrom renalne osteodistrofije - složeno kršenje metabolizma koštanog tkiva i homeostaze fosfor-kalcij. Smanjenje glomerula

filtracija proizvodi hiperfosfatemiju, hipokalcemija se razvija uz smanjenje sinteze vitamina D u bubrezima i otpornost na njegove učinke. Hiperfosfatemija može pridonijeti razvoju hipokalcemije zbog smanjenja apsorpcije kalcija u tankom crijevu, zbog stvaranja netopljivih apatita.

METABOLIČKE BOLESTI KOŠNICE

Metaboličke bolesti kostiju dijele se na osteoporozu, osteomalaciju, osteodistrofiju, osteogenezu imperfektu i osteoporozu. Bolesti kostiju mogu se razviti i na pozadini druge patologije, kao što je akromegalija ili ektopična kalcifikacija u stijenkama krvnih žila (s aterosklerozom i normalnim s formiranjem "cerebralnog pijeska" u epifizi).

Osteoporoza je najčešća metabolička bolest kostiju. Osteoporoza je tipična za mnoge bolesti koje karakterizira opći gubitak koštanog tkiva, koji premašuje starosne i spolne standarde i dovodi do smanjenja čvrstoće kostiju, što uzrokuje osjetljivost na prijelome (spontano ili uz minimalne ozljede). Osteoporozu treba razlikovati od osteopenije (starosne atrofije koštanog tkiva) i osteomalacije (narušena mineralizacija koštanog matriksa).

Čimbenici rizika za osteoporozu uključuju pripadnost bijelcu ili mongoloidnoj rasi, obiteljsku predispoziciju, tjelesnu težinu manju od 58 kg, pušenje i alkoholizam, nisku ili prekomjernu tjelesnu aktivnost, ranu menopauzu, kasni početak menstruacije, amenoreju i neplodnost, produljenu laktaciju (više od 6 mjeseci) više od tri trudnoće i porođaja u reproduktivnoj dobi, kao i zlouporaba kave (više od pet šalica dnevno), nedostatak unosa kalcija iz hrane i produljena parenteralna prehrana.

Klinička slika u većini slučajeva razvija se postupno, obično tijekom nekoliko godina. U laboratorijskoj dijagnostici važno je odrediti razinu alkalne fosfataze (koja se može prolazno povećati nakon prijeloma), kalcija i fosfata (obično normalna). Aktivnost resorpcije kosti određena je omjerom razine kalcija u urinu i kreatininom u urinu i omjerom sadržaja hidroksiprolina u urinu u odnosu na razinu kreatinina u urinu. Rendgenskim pregledom kralješnice otkriva se smanjenje gustoće kostiju s naglaskom

kortikalne konture. Izgled na radiografiji takvih odstupanja moguć je samo uz gubitak najmanje 30% koštanog tkiva.

Osteomalacija je skeletna patologija koja se javlja kada je organska matrica kostiju nedovoljno mineralizirana. U djece, riječ je o rahitisu (vidi dolje), u odraslih, metaboličkim poremećajima kalcija, fosfora i vitamina D.

Rahitis - bolest ranog djetinjstva, posljedica nedostatka vitamina D, koju karakteriziraju promjene u koštanom tkivu s razvojem skeletnih deformiteta. Sve patofiziološke procese uzrokuje hipokalcemija kao posljedica nedostatka vitamina D i njegovih metabolita. Kompenzacijska aktivacija paratiroidnih žlijezda i hiperprodukcija PTH, koja mobilizira izlučivanje kalcija iz kostiju i povećava apsorpciju kalcija i fosfatnih soli u crijevu, javlja se. Pojavljuju se hipofosfatemija, metabolička acidoza i osteogeneza.

Deformirajući osteodistrofija (osteitis deformirajući, Pagetova bolest) je nasljedna bolest koju karakterizira deformacija femoralne i tibialne kosti, kralježnice i lubanje s teškom hiperostozom, zadebljanjem i zakrivljenjem kostiju, povećanom učestalošću tumora. Obično se javlja u dobi od 50 godina. Klinička slika je obično asimptomatska, najčešća manifestacija je bol u kosti ili zglobu. Rijetko su zabilježeni deformiteti kosti, glavobolja, patološki prijelomi, povećanje tjelesne temperature preko zahvaćenog ekstremiteta, zatajenje srca s visokim srčanim otvorom i različiti neurološki poremećaji zbog kompresije živčanog tkiva (s oštećenjem lubanje, od kojih su najčešće gluhoća). Laboratorij karakterizira povećanje alkalnog fosfora i osteokalcina u osteosklerotičnoj fazi, povećanje razine hidroksiprolina u osteolitičkoj fazi. Serumski kalcij i fosfor obično su normalni.

Bubrega ili uremika, osteodistrofija je uobičajeno oštećenje kostiju, slično osteomalaciji, rahitisu ili fibroznom ostitisu; zabilježeno je kod kroničnog zatajenja bubrega.

Albrightova nasljedna osteodistrofija nastaje zbog otpornosti ciljnih stanica na djelovanje PTH (pseudohipoparitiroidizma). Bolesnici s pseudohipoparatiroidizmom su rezistentni na druge hormone koji djeluju preko adenilat ciklaznog sustava.

(hormon štitnjače, glukagon, FSH, LH). Kod ovih bolesnika uočen je karakterističan fenotip koji se manifestira brahidaktilijom, kratkom stasom, potkožnom osifikacijom. Albrightova bolest često se kombinira sa šećernom bolešću, arterijskom hipertenzijom, pretilošću, menstrualnim poremećajima (oligomenoreja), arteritisom, poliartrozom. Također karakterizira mentalna retardacija i konvulzije (zbog hipokalcemije).

Nesavršena osteosinteza je nasljedna bolest koja uzrokuje smanjenje koštane mase (zbog narušavanja osteogeneze) i uzrokuje njihovu povećanu krhkost; često praćena plavom diskoloracijom bjeloočnice, anomalijama zuba (nesavršena dentinogeneza) i progresivnim gubitkom sluha. Ultrazvuk otkriva teške oblike fetusa od 16. tjedna trudnoće. Dijagnoza je moguća uporabom DNK studija u uzorcima biopsije korionskih vilusa. Simptomatsko i ortopedsko liječenje.

Osteoporoza i osteoskleroza su kolektivni i, u praksi, identični koncepti koji karakteriziraju relativno povećanje sadržaja koštanog tkiva u kostima, što dovodi do smanjenja volumena šupljina koštane srži s neizbježnim oštećenjem hemopoeze.

Mramorna bolest. Poznato je nekoliko naslijeđenih oblika: dominantna nasljedna Albers-Schoenbergova bolest i recesivni oblici su maligni, benigni i smrtonosni oblici. Učestalost svih oblika - oko 1: 20.000 Klinički osteoporozu u ovoj patologiji pokazuje višestruke frakture, osteomijelitisa, hyperostosis lubanje, kronični rinitis zbog suženja nosnim prolazima, hepatosplenomegalija (uzrokovane kompenzacijski ekstramedularne hematopoeze) lica živca, anemiju (uzrokovan smanjenjem volumena koštane srži) i laboratorij - povećanjem razine alkalne fosfataze.

4.4. MARKERI RASTA MALIGNIČKIH RASTA

Nema sumnje da se uspjeh liječenja raka može očekivati samo kada se maligni tumori otkriju u ranom stadiju razvoja, no pitanje pravovremenog otkrivanja znakova takvih patologija još uvijek ostaje otvoreno.

Posljednjih godina dijagnostičke sposobnosti kliničkih onkologa značajno su se proširile u svezi s primjenom suvremenih instrumentalnih dijagnostičkih metoda: angiograma i limfografije, radionuklidne dijagnostike, računalne tehnike.

termo i rendgenski tomografi, radio-magnetska rezonanca, ultrazvuk pomoću Doppler efekta, koji omogućuju dobivanje slike u boji tumora i procjenu značajki mikrocirkulacije. Suvremene imunomorfološke i citološke studije omogućuju proučavanje uzoraka biopsije ne samo samog tumora, već i različitih izlučevina (sputum, urin, ascitna tekućina). Trenutno, složena laboratorijska biokemijska i imunološka dijagnostika temelji se na identifikaciji tumorskih biljega, hormona, biološki aktivnih spojeva, enzimskih izoformi, kao i metabolita koštane pregradnje u slučaju metastatskih koštanih lezija.

Početak proučavanja tumorskih biljega bio je vrlo ohrabrujući. Već krajem 19. stoljeća u mokraći bolesnika s multiplim mijelomom pronađeni su specifični proteini (imunoglobulini), koji su se zvali Bens-Jones proteini, ali je sljedeći uspjeh morao čekati više od 80 godina. To je povezano s otkrićem GI. Abelev i Yu.S. Tatarin α-fetoprotein u krvi bolesnika s hepatomom. Ove studije označile su početak nove faze u istraživanju čimbenika povezanih s rastom malignih tumora, au dvadesetom stoljeću doveli su do otkrića niza različitih spojeva, nazvanih "tumorski markeri". Klinički biokemičari često koriste markere za identifikaciju primarnog tumora i njegovih metastaza. Markeri malignog rasta uključuju tvari različite prirode. To uključuje više od 200 spojeva: antigeni, hormoni, enzimi, glikoproteini, lipidi, proteini, metaboliti, čija koncentracija korelira s masom tumora, njegovom proliferativnom aktivnošću, au nekim slučajevima i sa stupnjem malignosti neoplazme. Abnormalna ekspresija genoma je jedan od glavnih mehanizama proizvodnje markera od strane tumorskih stanica, koji određuje sintezu embrionalnih, placentnih i ektopičnih proteina, enzima, antigena i hormona.

Kao idealan test za ranu dijagnozu malignih tumora, predloženi su mnogi markeri, ali do sada nije pronađeno rješenje. Poteškoće zbog raznolikosti zahtjeva za idealnim markerom. Idealni tumorski biljeg treba proizvesti tumorska stanica u dovoljnim količinama, tako da se može odrediti modernim metodama. Ne smije biti prisutan u zdravih ljudi i benignih tumora,

marker bi trebao biti otkriven u ranim fazama tumorskog procesa, broj tumorskog markera trebao bi biti izravno proporcionalan volumenu tumora, te bi se marker trebao odrediti prije kliničkih manifestacija tumora, razina idealnog markera treba korelirati s rezultatima antitumorskog liječenja.

U kliničkim studijama koristi se niz dovoljno djelotvornih tumorskih biljega, koji, međutim, ne zadovoljavaju uvijek sve gore navedene kriterije. Suvremene biokemijske i imunološke metode mogu otkriti tumore kada uvjetni broj tumorskih stanica dosegne 10 9 -10 10, a minimalna razina markera koju izlučuje tumor je od jednog do nekoliko femtomola (sve brojke temelje se na 1 ml krvnog seruma). Visoka učinkovitost korištenja tumorskih biljega u klinici može se postići kombinacijom različitih testova. Treba napomenuti da se broj predloženih markera za dijagnozu i praćenje malignih tumora stalno povećava, te dolazi do kritičnog preispitivanja s ciljem formiranja strategije i adekvatne primjene.

4.4.1. TUMAČENJE REZULTATA ISPITIVANJA TUMORSKIH MARKERA

Određivanje koncentracije tumorskih biljega u različitim novotvorinama zahtijeva poznavanje faktora, in vivo i in vitro, koji utječu na rezultate ili ih iskrivljuju. To bi trebalo jednako uzeti u obzir ne samo za laboratorijske liječnike, nego i za liječnike koji su izravno odgovorni za proces promatranja i liječenja određenog pacijenta. Sljedeći su glavni čimbenici koji utječu na definiciju tumorskih biljega.

• stupanj ekspresije i sinteze markera;

• otpuštanje markera od strane tumorskih stanica;

• lijekove i kemoterapijske lijekove;

• izlučivanje iz tijela;

• intenzitet dotoka krvi u tumor;

• položaj tijela pacijenta tijekom uzorka krvi;

• instrumentalne i ne-instrumentalne metode ispitivanja (na primjer, bronhoskopija ili biopsija);

• katabolizam tumorskih markera (na primjer, funkcionalno stanje jetre i bubrega);

• loše navike (pušenje, konzumiranje alkohola). In vitro:

• uvjeti skladištenja uzoraka;

• vremenski interval između prikupljanja krvi i centrifugiranja (s odvajanjem seruma);

• stupanj hemolize i žutkost;

• kontakt krvnih žila s kožom;

• onečišćenje uzorka slinom;

• utjecaj droga;

• prisutnost antitijela na mišje imunoglobuline u krvi bolesnika (nakon dijagnostičke imunoscintigrafije i imunoterapije);

• metodološka pogreška u određivanju tumorskog markera. Potrebno je uzeti u obzir da većina cirkulira

Markeri krvi tumora nisu prikladni za probiranje pacijenata u odsutnosti simptoma, budući da postoji niz ograničenja povezanih s često niskom dijagnostičkom osjetljivošću i specifičnošću, kao i ograničenom prediktivnom vrijednošću. Istovremeno, postoji niz prepoznatih slučajeva kada je teško upravljati bez definicije tumorskih biljega.

To je, prvo, procjena učinkovitosti terapije. U ranim stadijima, promjene u koncentraciji tumorskog markera mogu pokazati da li će odabrana kemoterapija biti uspješna ili (u slučaju stalnog povećanja koncentracije) potrebna je korekcija terapije, sve do otkazivanja. Naravno, testiranje tumorskog markera je apsolutno besmisleno u slučajevima teškog raka.

Drugo, praćenje tijeka bolesti. Korištenje tumorskih biljega za praćenje tijeka neoplazme često omogućuje otkrivanje metastaza i / ili recidiva tumora za 3-5 mjeseci ili više prije kliničkih manifestacija bolesti. Kod nekih bolesnika testiranje tumorskih biljega nakon kirurškog uklanjanja mjesta primarnog tumora može omogućiti osjetljivije praćenje od endoskopije, ultrazvuka ili kompjutorske tomografije. Stopa porasta razine tumora

oznaka vam obično omogućuje da donesete zaključak o brojnim opažanjima

Priroda progresije bolesti, posebice o metastazama. Poznavanje prirode promjena razine tumorskog markera također vam omogućuje da optimizirate vrijeme naknadnog detaljnog pregleda pacijenta. Dok se održava niska ili normalna razina tumorskog markera tijekom dovoljno dugo vremena, naknadni pregled, uključujući invazivne ili skupe tehnike, čini se suvišnim. Naprotiv, ako se razina tumorskih markera poveća, a informacije o progresiji bolesti su potrebne pri odlučivanju o taktici liječenja, prikazane su takve studije.

Treće, identifikacija rezidualnih i rekurentnih tumora. Neadekvatno slabo smanjenje razine tumorskog markera ili odsustvo smanjenja općenito ukazuje na nepotpuno uklanjanje tumora ili prisutnost višestrukih tumora (metastaza). Takve informacije mogu imati terapeutsko i prognostičko značenje.

I konačno, četvrto, predviđanje tijeka tumorskog procesa. Riječ je o izuzetno intenzivnom razvoju suvremenog područja primjene tumorskih biljega, posebice onih čije je istraživanje povezano s prognozom i, shodno tome, prvenstveno utječe na izbor terapije.

4.4.2. KOLOREKTNI RAK

U europskim zemljama bolest raka debelog crijeva (CRC) postaje bolesna

1 od 20 osoba. Rijetko se ova vrsta raka nalazi u Africi i dijelovima Azije. Sada u Rusiji, stopa otkrivanja CRC-a monotono raste.

Trenutno se molekularne metode u dijagnostici CRC-a smatraju vrlo perspektivnim i važnim područjem istraživanja, a to je zbog činjenice da se događaji na razini genoma trebaju smatrati ključnim za pojavu i napredovanje ovih tumora. Postoje brojne pouzdane činjenice koje pokazuju da CRC u ranim fazama razvoja može i mora biti identificiran molekularnim metodama. Metode molekularne dijagnostike CRC-a također omogućuju propisivanje adekvatnog liječenja i precizno predviđanje rezultata.

CRC nastaje kao posljedica uzastopnih promjena (displazija / adenom-adenokarcinom), koje se temelje na genetskim

povrede. Međutim, mehanizmi odgovorni za pojavu i nakupljanje takvih poremećaja u epitelnoj stanici nisu u potpunosti shvaćeni. Primjer poteškoća u načinu proučavanja ovog problema je činjenica da postoje razlike u učestalosti pojave benignih i malignih faza bolesti, odnosno u sekvenci displazije / adenoma-adenokarcinoma. Dokazano je da se do devete decenije života kod više od polovice populacije javljaju kolorektalni adenomi, a CRC se razvija samo u 5% populacije. Posljedično, samo se nekoliko prekanceroznih promjena pretvara u rak.

Dakle, uz starost i kronične upalne bolesti (ulcerozni kolitis, Crohnova bolest ili zahvaćanje debelog crijeva s shistosomijazom), CRC u krvnim srodnicima je prepoznat, ako ne i glavni čimbenik rizika. Uzroci koji uzrokuju CRC u jednom članu obitelji mogu varirati od rijetkih autosomno dominantnih sindroma s visokom učestalošću CRC (obiteljski adenomatozni polipozi, nasljedni nepolipični CRC sindrom) do manje genetski jasnih uvjeta, kao što je, na primjer, otkrivanje adenoma u najbližem rodbina (roditelj, brat ili sestra). Poznato je da se CRC javlja u mlađoj dobi, što je veći statistički rizik od njegove pojave kod bliskih srodnika. Nasljedni sindromi CRC-a prikazani su u tablici. 4.6 prema fenotipu i mutacijama u odgovarajućim genima.

Valja napomenuti da je proučavanje molekularnih mehanizama na kojima se zasnivaju rijetki nasljedni sindromi doprinijelo razumijevanju patogeneze sporadičnog CRC-a, koji se češće uočava u populaciji, ali na temelju sličnih ili sličnih molekularnih događaja.

Uloga molekularno-genetskih poremećaja u pojavi CRC-a, a posebno nestabilnosti genoma, intenzivno se proučava relativno nedavno. Godine 1993. pronađena je mikrosatelitska nestabilnost (MSI) u članova obitelji s nasljednim karcinomom debelog crijeva (RTC). Ovo otkriće poslužilo je kao osnova za hipoteze o mutacijskom fenotipu raka, koje je razvio Loeb, prema kojem stanica mora preživjeti različite mutacije kako bi postala kancerogena. Ali za to bi u početku trebalo imati sposobnost mutiranja češće nego normalno, a to opet može

Tablica 4.6. Nasljedni sindromi CRC

Tablica 4.7. Vrste genetskih poremećaja i molekularni markeri u CRC

biti povezan s inaktivacijom mehanizama odgovornih za normalno očuvanje strukture DNA.

U gotovo svim slučajevima RTK, zabilježena je kromosomska nestabilnost ili MSI nestabilnost. Zapravo, postoji obrnuti odnos između ta dva kršenja. Tako su maligni tumori koji imaju MSI nestabilnost obično diploidni i nemaju kromosomske aberacije. Tumori s kromosomskom nestabilnošću karakterizirani su aneuploidijom i često su popraćeni gubitkom ili pojavom dodatnih kromosoma. Često otkrivanje kromosomske nestabilnosti ili MSI nestabilnosti u ovom slučaju ne ukazuje na to da je to vrlo čest i nespecifičan fenomen u procesu nastanka bilo kojeg malignog tumora, ali da je nestabilnost genoma usko povezana s tumorogenezom.

I kromosomska nestabilnost i MSI nestabilnost mogu se otkriti u vrlo ranim fazama RTK. Koristeći komparativnu hibridizaciju genoma za određivanje prosječnog broja pogrešaka tijekom kopiranja, mogli smo pokazati njihovo postupno povećanje s napredovanjem adenoma s blagom displazijom do adenoma s teškom displazijom i kasnijom transformacijom u rak (tablica 4.8).

Tablica 4.8. Kromosomska nestabilnost u slučaju RTK

Bolesnici s nasljednom predispozicijom zbog poremećaja APC gena, uključujući poremećaje nukleotidne sekvence i ekspresiju gena, razvijaju tumore, koji se obično razvijaju kao posljedica kromosomske nestabilnosti, koju karakterizira gubitak alela i citogenetski poremećaji. Tumori se kod nekih bolesnika s sporadičnim CRC javljaju na isti način.

Nasuprot tome, kod pacijenata s nasljednim nepolipoznim CRC sindromom, mutacije u grešci DNA koje ispravljaju DNA rezultiraju tumorima koje karakterizira MSI nestabilnost i nukleotidi detektirani kao ponovljene nukleotidne sekvence, od kojih su neke smještene u kodonima gena. Rijetko se uočava gubitak alela. Ovaj tip molekularne patologije je također uočen u oko 15% slučajeva sporadičnog CRC-a i često je povezan s anatomskim značajkama, kao što je položaj u proksimalnom crijevu (uzlazni debelo crijevo); niska diferencijacija tumorskih stanica sa sluzom, medularnom ili krikoidno-staničnom komponentom; prisutnost značajnog broja limfoidnih folikula s germinalnim centrima na periferiji tumora; infiltracija tumora limfocita.

Neučinkovita transkripcija gena kao rezultat aberantne metilacije citogenetskih sekvencija gvanina (C-G otoci) u promotorskim regijama gena trenutno se smatra jednom od komponenti molekularne patogeneze treće CRC podvrste.

Primjena molekularnih dijagnostičkih metoda u bolesnika ima veliki potencijal kako u ranoj dijagnostici i procjeni odgovora tumora na terapiju, tako iu prognozi bolesti. Kao što je prikazano u tablici. 4.9, uz takvu dijagnozu, možete koristiti različite predmete proučavanja.

U onih pacijenata koji već imaju CRC, molekularne metode mogu se koristiti za identifikaciju mikrometastaza, točnije procjenu stadija tumorskog procesa, posebice za otkrivanje mikrometastaza u limfnim čvorovima ili za procjenu moguće hematogene diseminacije tumorskih stanica u koštanoj srži.

Osim toga, molekularna dijagnostika ima veliki potencijal za otkrivanje genotipskih i fenotipskih svojstava tumora, koji određuju cijeli niz događaja koji dovode do metastaze stanica, tzv.

Tablica 4.9. Primjena molekularnih dijagnostičkih metoda za CRC

genotip i fenotip. Markeri ovog tipa mogli bi ukazati na veću vjerojatnost napredovanja tumorskog procesa nakon radikalne operacije.

Identificirane su genetske abnormalnosti povezane s predviđanjem ili odgovorom na kemoterapiju za CRC, uključujući gubitak alela na 18q, nestanak ekspresije DCC gena, abnormalnosti u genu p53, gubitak alela na kratkom kraku kromosoma 1 i 5, RAS mutacije. Studije kliničke učinkovitosti korištenja takvih molekularnih markera su uvjerljivo formulirane, trenutno se provode i uključuju reprezentativni uzorak populacije. Za široku primjenu u kliničkoj praksi, molekularna istraživanja moraju zadovoljiti sve zahtjeve za rutinske laboratorijske testove, kao što su reproducibilnost, dostupnost i odgovarajuća kontrola kvalitete. Konačno, rezultati istraživanja molekularnih markera trebali bi lako tumačiti kliničari i imati terapeutsku vrijednost.

Složenost i višestrukost genetskih i biokemijskih procesa koji se javljaju u stanicama raka, koji im omogućuju metastaziranje, otežavaju tumačenje vrijednosti takvih markera. Osim toga, faktori koji nisu izravno povezani s tumorom, kao što je kvaliteta kirurške tehnike, značajno utječu na konačni rezultat. Među genima tumorskih markera koji predviđaju terapijski odgovor, pozornost je bila usmjerena na p53 i gene regulirane apoptozom koje su regulirane p53.

Jedno od područja molekularno-genetičkog istraživanja tumora je identifikacija molekularnih poremećaja karakterističnih za kasniji razvoj metakronskih tumora, koji se ponekad pogrešno smatraju ponovljenim glavnim tumorom. Takve studije uključuju proučavanje kolorektalnih adenoma kao cilja za identificiranje markerskog gena zbog njihove visoke učestalosti u populaciji kao prekancerozne promjene u usporedbi s niskom frekvencijom detekcije malignih tumora. Molekularni marker koji ukazuje na visoku vjerojatnost razvoja metakrona adenoma, posebno adenoma, koji se mogu pretvoriti u maligni tumor, može biti koristan za identificiranje rizičnih skupina za kasniji kolonoskopski skrining.

Nasuprot tome, pacijenti kod kojih je malo vjerojatno da će metahronski adenomi napredovati, mogu biti isključeni iz probira. Strategija uklanjanja adenoma pokazala je da je povezana s smanjenjem učestalosti CRC-a, a molekularni markeri koji identificiraju pacijente s većim rizikom mogu biti korisni.

Istraživanje uzoraka stolice i krvi također ima veliki potencijal. Stoga je uporaba vrlo jednostavnog testa za skrivenu krv u izmetu smanjila smrtnost od CRC-a, ali njegova specifičnost ostaje relativno niska. Molekularni testovi za otkrivanje fragmenata DNA tumora su progresivniji. Brojne su studije pokazale da se mutacije koje sadrže DNK mogu identificirati u izmetu i krvi pacijenata koji imaju tumore s tim mutacijama. Dijagnoza tumora, probir i dinamičko promatranje pacijenata mogu se značajno poboljšati ako se prevladaju određene tehničke poteškoće i njihovi troškovi su uravnoteženi.

Trenutno istraživači posvećuju veliku pozornost proučavanju mogućnosti korištenja molekularno-genetskih markera CRC-a. U nastavku slijedi kratka karakterizacija tumorskih markera koji se danas najčešće koriste u kliničkoj praksi.

Po prvi put, antigen zametka raka (CEA) otkriven je 1965. godine Goldom i Freedmanom u istraživanju ljudskog gastrointestinalnog tkiva i adenokarcinoma debelog crijeva. Kasnije je CEA detektiran u serumu bolesnika s CRC. Ta prva djela bila su vrlo ohrabrujuća. Tada se činilo da su mnogi pronašli

vrlo specifičan test za dijagnozu RTK. Međutim, kasnije, kako su se metode otkrivanja CEA i akumulacije kliničkih podataka poboljšale, taj se marker također može izolirati u drugim tumorima (rak gušterače, jetre, pluća, štitnjače i neuroblastoma), kao iu ne-neoplastičnim bolestima (ciroza jetre, ulcerativni kolitis, pankreatitis, kronični bronhitis, emfizem, virusni hepatitis, divertikulitis, polipi, zatajenje bubrega). Stoga je nemoguće u otkrivanju CEA apsolutno točno reći da pacijent ima ovu vrstu raka. Istovremeno, CEA je još uvijek prvi izbor za CRC i koristi se s visokom učinkovitošću u praćenju bolesti, ali se glavna pozornost posvećuje kvantitativnim parametrima metode.

U 99% zdravih osoba razina CEA je manja od 5 ng / ml. S CRC osjetljivost testa varira od 25 do 80% i ovisi o veličini i stupnju diferencijacije tumora, kao io opsegu procesa. Razina CEA korelira s fazom tumorskog procesa. Dakle, prema sažetim podacima različitih autora, u skladu s fazama prema Dukesovoj klasifikaciji, za antigen je karakteristično povećanje njegove koncentracije: u fazi A - 7.8 ng / ml, B - 30.3 ng / ml, C - 58.1 ng / ml, D - 134,3 ng / ml. U isto vrijeme, učestalost otkrivanja CEA (na pragu markera od 5 ng / ml) u skupinama bolesnika s naznačenim stadijima povećala se i odgovarala je 3, 25, 45 i 65%, a na graničnoj vrijednosti markera> 2,5 ng / ml nađeno je još češće s gore navedenim Dukes faze i odgovarao 28, 45, 75 i 84%. S obzirom na činjenicu da je u stadijima A i B tumorski marker povećan samo u 3-28% bolesnika, njegova je uporaba u ranoj dijagnozi CRC problematična. Visoko diferencirani tumori aktivnije proizvode CEA.

Prema mnogim autorima, marker ima prognostičku vrijednost, što leži u činjenici da visoka početna razina CEA u krvnom serumu (više od 25 ng / ml) ukazuje na visok rizik razvoja ranog recidiva CRC nakon kirurškog uklanjanja tumora.

Primjer uporabe CEA je određivanje radikalne prirode kirurške intervencije u CRC-u. U pravilu, nakon radikalnog kirurškog uklanjanja tumora, do kraja 6. tjedna koncentracija antigena postaje ispod normale. Ako razina biljega ne padne nakon uklanjanja primarnog tumora,

misliti da pacijent ima metastaze. Preporučljivo je odrediti CEA u bolesnika u postoperativnom razdoblju nakon 3 mjeseca tijekom 2 godine. Redovitim praćenjem bolesnika s CRC-om s uključenim CEA-om povećava se stopa preživljavanja od 5 godina. Adjuvantna kemoterapija (5-fluorouracil i levamisol) u bolesnika s CRC može uzrokovati prolazno povećanje razine CEA u krvnom serumu. Ne preporučuje se rutinsko određivanje CEA u praćenju odgovora na terapiju, međutim, ne postoje alternativni testovi za procjenu odgovora na liječenje u bolesnika s CRC.

U većine bolesnika s RTK (79,1%), u usporedbi s kontrolnom skupinom (10%), otkrivena su IgM i IgG protutijela na CEA, što također omogućuje korištenje ovog pokazatelja kao dijagnostičkog markera i nezavisnog prognostičkog faktora. Istodobno, otkrivanje protutijela na CEA u serumu bolesnika s CRC povezano je s boljom prognozom i značajnim povećanjem 2-godišnje preživljavanja.

Analiza razine CEA u ispiranju debelog crijeva prije endoskopskog rutinskog pregleda pokazala je da ovaj jednostavan test može biti koristan u praktičnoj medicini za identifikaciju skupina pacijenata s visokim rizikom od CRC.

Korištenje CEA u dijagnostičke svrhe ograničeno je niskom specifičnošću, zbog povećanja koncentracije antigena u serumu u ne-neoplastičnim bolestima, kao i djelovanja određenih egzogenih i endogenih čimbenika na sintezu tog markera. Stoga, kod ispitivanja bolesnika s tumorom kolona, CA-19-9 se koristi kao marker drugog izbora (vidi dolje). To je posebno važno u slučaju REA-negativnih neoplazmi.

S obzirom na nisku osjetljivost i specifičnost, također se ne preporučuje korištenje definicije CEA u screeningu za CRC. U slučaju 5-strukog povećanja CEA u serumu i prisutnosti kliničkih pritužbi kod pacijenta, treba predložiti CRC.

Usporedna analiza triju tumorskih biljega (CA-19-9, CEA i α-fetoproteina) u serumu bolesnika s RTK-om u različitim fazama tumorskog procesa, u bolesnika s kroničnim ulceroznim kolitisom i zdravim osobama, otkrila je značajnu razliku između bolesnika s lokaliziranim RTK i kroničnim ulceroznog kolitisa u smislu CA-19-9 i CEA, kao i između lokalizirane i generalizirane RTK za gornja dva

tumorski markeri. Vrijednosti tumorskih biljega kod kroničnog ulceroznog kolitisa nisu bile veće od normalnih. U lokaliziranom procesu, razina CA-19-9 ne prelazi 1000 jedinica / ml, CEA-20 ng / ml. Parametri α-fetoproteina u bolesnika s CRC-om su u granicama normale i povećavaju se, u pravilu, samo kada se generalizira tumorski proces, što ne dopušta korištenje ovog markera u dijagnostici bolesti. Kada se koristi kompleks CA-19-9 + REA, dijagnostička osjetljivost je 91% i značajno premašuje onu kada se koristi samo jedan tumorski marker. Pristupanje instrumentalnim metodama dijagnostike podataka o definiciji tumorskih biljega (CA-19-9 i CEA) povećava učestalost detekcije lokaliziranog CRC-a za 14%, a tijekom generalizacije procesa - za 9%.

Za tumore koje karakterizira neravnoteža između procesa proliferacije i apoptoze. Endotelin-1, polipeptid od 21 aminokiselinskih ostataka, ima vazokonstriktornu i mitogenu aktivnost, te je također uključen u mehanizme regulacije apoptoze. Eksperiment je pokazao da je endotelin-1 faktor preživljavanja i sposoban je in vitro zaštititi PTK stanice od FasL-inducirane apoptoze.

Učestalost otkrivanja i razina topivog Fas antigena (sFas) - inhibitora apoptoze - u serumu bolesnika s RTK viša je nego u praktično zdravih ljudi. Postoji tendencija povećanja sadržaja sFas u serumu u bolesnika s RTK s metastazama u regionalnim limfnim čvorovima i jetri, što omogućuje raspravu o ulozi Fas / FasL sustava kao mogućoj meti za antitumorsku terapiju u bolesnika s CRC.

Pokazano je da visoka aktivnost kaspaze-3 korelira s visokim rizikom od recidiva RTK-a, osobito u slučajevima njegove desno strane lokalizacije. Također je detektirana korelacija aktivnosti kaspaze-3 s CD57 + stanicama za filtriranje tumora.

Važnu ulogu u mehanizmima regulacije apoptoze u PTK-u igra bcl-2, koji se normalno izražava stanicama koje oblažu dno kripta kolona. Pokazalo se da je ekspresija bcl-2 u BK stadiju RTK Dukesa povezana s boljim preživljavanjem pacijenata i, prema tome, za pacijente kod kojih tumori ne eksprimiraju bcl-2, preporučljivo je provesti adjuvantnu terapiju.

Ekspresija imunoreaktivnog p53 u primarnom tumoru u CRC je marker visokog rizika od recidiva bolesti nakon kirurškog uklanjanja bolesti i češće nakon prve godine promatranja. U isto vrijeme, povećana ekspresija p53 otkrivena je u 47, a CEA u 34,4% tumora. Vjeruje se da je pri procjeni prognoze CRC-a potrebno definirati oba markera.

Poznato je da genetska oštećenja razlikuju primarne karcinome proksimalnog i distalnog kolona. Stoga, multivarijatna analiza ekspresije p53 u primarnom CRC češće otkriva povećanu ekspresiju p53 u distalnom (58,5%) nego proksimalnom (41,7%) RTK. Istodobno je period bez relapsa manji kod p53 + tumora (75 i 38%, redom, p = 0,006). Kod p53 + tumora s distalnom lokalizacijom zabilježen je visoki rizik od recidiva CRC. Stoga, procjena ekspresije p53 u CRC može poslužiti kao marker za ranu ponovnu pojavu bolesti i povezana je s lokalizacijom tumora u organu.

Dokazano je da je neuspjeh kemoterapije u CRC povezan s rezistencijom ovih tumora na više lijekova. Pokazalo se da je ekspresija različitih CD44 izoforma povezana s agresivnim ponašanjem tumora i postavlja pitanje da li signal iz tog receptora modulira osjetljivost lijeka na tumor. Također je dokazano da CD44 inducira aktivaciju LYN i Akt src obitelji tirozin kinaza. Sposobnost suzbijanja apoptoze može igrati ključnu ulogu u razvoju tumora kolona, što je povezano s ekspresijom CD44.

Aktivatori i inhibitori plazminogena

Posljednjih godina, istraživanje metaloproteinaza izvanstaničnog matriksa, koje su usko povezane s procesima invazije i metastaza tumora, privuklo je veliku pozornost istraživača. S razvojem metastaza, trebao bi postojati lanac sekvencijalnih događaja koji dovode do oslobađanja tumorskih stanica iz njihovog izvornog okoliša i formiranja tumorskih čvorova u udaljenim organima i tkivima. Pretpostavlja se da je za osiguravanje procesa invazije i metastaze potreban kompleksni proteolitički lanac, uključujući različite proteaze. Vjeruje se da plazmin, koji smanjuje razinu izvanstaničnih matričnih glikoproteina i aktivira neke prometaloproteaze, igra ključnu ulogu u procesima invazije i metastaze, dok

u višestupanjskom lancu proteaze, serinska proteaza je ključna pozicija - urokinazni aktivator plazminogena (uPA), budući da katalizira stvaranje plazmina iz njegovog prekursorskog plazminogena. IRA receptor (Pc-uPA) također igra važnu ulogu, budući da, kada se uPA veže na receptor, njegova sposobnost da aktivira plazminogen raste. S druge strane, inhibitori uPA-PAI-1 i PAI-2 mogu biti prisutni u PTK tkivima. Pokazano je da su razine uPA i PAI-1 u CRC-u veće nego u homolognim normalnim tkivima i benignim tumorima.

Pitanje da li je uPA u ljudskoj RTK izvedena iz samih stanica raka ili od elemenata okolne strome (fibroblasti, makrofaga, leukocita) je dugo ostala bez odgovora. Na kraju, Harvey i sur. bilo je moguće dokazati da aktivator potječe iz samih stanica raka, a nije posuđen od elemenata strome, a antigen se najintenzivnije otkriva u apikalnim i bazalnim područjima PTK stanica.

Najreprezentativnije istraživanje komponenti sustava aktivacije plazminogena u uzorcima CRC provedeno je od strane Fujii et al. Također su analizirali ekspresiju uPA i PAI-1 gena metodom PCR. UPA ekspresija je otkrivena u 58,8% tumora. U bolesnika s pozitivnim uPA i negativnim rezultatima za PAI-1, prognoza 5-godišnjeg preživljavanja bila je značajno lošija. Multivarijatna analiza pokazala je da su rezultati istovremenog određivanja uPA i PAI-1 u CRC nezavisni prognostički pokazatelji.

Preživljavanje pacijenata nakon operacije nije koreliralo sa sadržajem uPA u stromi tumora, međutim, uočen je obrazac povezan s njegovom razinom u tumorskom epitelu, tj. Određivanje razine uPA može biti test za dijagnosticiranje RTK bez metastaza, kao i rizik od ranog relapsa. nakon operacije. Moguće je da proteaze mogu biti ciljane lijekovima koji sprječavaju invaziju i metastaziranje CRC-a.

Metastaze u jetri važan su čimbenik koji ograničava prognozu u bolesnika s RTK. Postoji korelacija između iRA i jetrenih metastaza. Transdukcija tPA gena u PTK stanice može biti korisna u smislu suprotstavljanja jetrenim metastazama.

Najmanje proučavano u kliničkom smislu, komponenta sustava aktivacije plazminogena smatra se Rc-uPA, koja je membranski vezana tri-domena glikopeptida. ovo

receptor također može postojati u topljivom obliku (rRc-uPA) u ekstraktima iz tumora, kao iu krvnoj plazmi i zdravih ljudi i pacijenata oboljelih od raka. Topljiva Rc-uPA u plazmi je praktički nepromijenjena molekula, međutim, ni točan mehanizam njegovog oslobađanja s površine stanice, niti njegova biološka funkcija, nisu u potpunosti istraženi. Povišene razine rRs-uPA u plazmi detektirane su u bolesnika s RTK, a koncentracija rRs-uPA povezana je s prognozom bolesti. Moguće je da Pc-uPA može značajno doprinijeti poboljšanju angiogeneze oko tumora, kao i mikrovaskularnim metastazama.

Stoga, povećana ekspresija Rc-uPA, koja karakterizira invazivnu sposobnost tumora in vitro u barem nekim subpopulacijama RTK stanica, djelomično je rezultat konstantne aktivacije signalne kaskade ovisne o protein kinazama aktiviranim mitogenom.

Receptori faktora rasta

Jedan od važnih regulatornih sustava za mitogenu transdukciju signala je familija tirozin kinaznih receptora - produkata c-erbB skupine onkogena, koja uključuje četiri transmembranska receptora sa sličnom strukturom - receptorom epidermalnog faktora rasta (EPRF ili ErbB1), kao i ErbB2 (HER2 / neu) ErbB3 (HER3) i ErbB4 (HER4). Osim strukture, ovi receptori se razlikuju u relativnoj specifičnosti i afinitetu za različite uobičajene ligande. Nakon aktivacije kao posljedice vezanja liganda i dimerizacije, unutarnja receptorska tirozin kinaza se aktivira i dobiva sposobnost fosforiliranja i samog receptora i drugih staničnih proteina uključenih u prijenos mitogenog signala.

Različiti faktori rasta su uključeni u autokrinu i parakrinu regulaciju proliferacije CRC stanica. Posljednjih godina, klinički značaj receptora faktora rasta i njihovih liganada aktivno je proučavan u CRC-u, ponajprije RESR, receptoru faktora rasta sličnog inzulinu tipa 1 (RIGR-1), receptoru faktora rasta vaskularnog endotela (R-VEGF).

REFR je c-erbB1 onkogenski proizvod, koji je transmembranska tirozinska kinaza, najčešće proučavana u kliničkim terminima za ovu skupinu u tumorima različite lokalizacije, ali nedovoljno proučena u CRC.

Receptori obitelji ErbB mogu tvoriti i homo- i heterodimere, au mnogim slučajevima heterostrukture uz sudjelovanje drugog predstavnika ove obitelji, najaktivniji su HER2 / neu, koji nema vlastiti ligand. Dakle, HER2 / neu je ključni element u prijenosu mitogenih signala EGF-sličnih faktora rasta i njegovo blokiranje može značajno usporiti ili zaustaviti rast tumora koji ovise o takvim stimulusima. Vjeruje se da povećana ekspresija HER2 / neu u tumorima, uključujući CRC, može poslužiti kao marker osjetljivosti i cilj za učinkovitiju bioterapiju tih tumora. Kliničke studije su u tijeku, a preliminarne studije o ekspresiji HER2 / neu u prognozi tumora gastrointestinalnog trakta prikazane su u literaturi.

RIFR-1 i RIFR-2 su potencijalni mitogeni i jaki stimulatori rasta tumorskih stanica. Učinci koji potiču rast oba tipa FGID-a su posredovani, uglavnom FGED-1. Za sada ne postoji jedinstveno mišljenje o kliničkoj vrijednosti RIFR-1 u CRC-u.

Većina studija pokazala je inverzni odnos između otkrića receptora steroidnih hormona (endokrini tip regulacije) i EGFR (auto i parakrini tip regulacije) u tumorima.

Blokiranje bilo kojeg stupnja prijenosa mitogenog signala faktora rasta može u načelu dovesti do disregulacije proliferacije tumorskih stanica i potencijalno inhibicije rasta tumora. Eksperiment je već istraživao dovoljno velik broj lijekova koji utječu na gore navedene procese: specifični i nespecifični blokatori vezanja EGFR na ligande, inhibitore tirozin kinaze i druge kinaze, blokatore vezivanja SH2 domena efektornih proteina s aktiviranim receptorom, spojeve koji potiskuju aktivaciju ras gena, uključujući inhibitore farnezilacije. Većina njih nalazi se u fazi kliničke studije, iako su neki, posebno Herceptin, već prošli klinička ispitivanja i pokazali su se vrlo učinkoviti u nekim tipovima tumora.

Poznato je da su RTK-ovi ciljana tkiva steroidnih hormona iu 25-60% slučajeva zadržavaju funkcionalnu sposobnost primarne veze mehanizma djelovanja jednog ili više steroida, naime estrogenskih receptora (RE; 40,9%), androgena (RA; 15,5%). ), progesteron (RP; 32,6%) i glukokortikoidi (WG; 59,1%).

Međutim, samo prisutnost ER i RP u tumoru može se koristiti kao kriterij za povoljnu prognozu 10-godišnjeg preživljavanja bolesnika s CRC. Istodobno, re-EG se češće otkrivaju u RTK kod žena (60,5%) nego u muškaraca (39,5%), s lokaliziranim stadijem bolesti (63,1%) i tumorom u desnim dijelovima debelog crijeva (59,4%).

Tumorski markeri angiogeneze

Istraživači su pokazali veliko zanimanje u posljednjih nekoliko godina za proučavanje angiogenih čimbenika u tumoru, a posebno za VEGF. Sve je više dokaza da metastaze u različitim stadijima tumorskog procesa ovise o stupnju vaskularizacije tumora.

Kod hematogenih metastaza, tumorske stanice moraju se lijepiti za endotelne stanice, proći u lumen žile, preživjeti u cirkulirajućoj krvi, zaustaviti se u određenom organu ili tkivu i tamo formirati koloniju. Visoki angiogeni primarni tumori, uključujući CRC, s visokom intratumoralnom vaskularnom gustoćom vjerojatno će proizvesti angiogeni klon u udaljenom organu, koji pod povoljnim uvjetima može formirati metastaze. Većina istraživača vjeruje da je visoki stupanj vaskularizacije tumora statistički značajan marker za prisutnost metastaza u regionalnim limfnim čvorovima. U 77% prethodnih studija utvrđena je značajna povezanost između angiogeneze tumora i razvoja udaljenih metastaza. Iako postoje značajne razlike u ispitivanim skupinama pacijenata i metode koje se koriste za procjenu angiogeneze, većina istraživača pokazala je inverzni odnos između vaskularizacije tumora i preživljavanja bolesnika s CRC. Osim toga, nedovoljna vaskularizacija i kao posljedica toga hipoksija povećavaju ekspresiju gena povezanih s rezistencijom (Pg-glikoprotein, hidrofolat reduktaza) na kemoterapiju i predstavljaju važnu neučinkovitost neoadjuvantnog zračenja i kemoterapije.

U većine bolesnika (73,4%) s regionalnim metastazama u limfnim čvorovima razdoblje bez relapsa bilo je značajno veće u odsutnosti ekspresije VEGF-a i niskog indeksa SPF (faze S-faze) u tumoru. Pored prognostičkog značaja VEGF, pokazalo se da blokiranje VEGF receptora-2 inhibira rast CRC metastaza u jetri.

Trenutno, više od 200 spojeva ima angiogenu aktivnost i svi se mogu podijeliti u dvije skupine prema inhibicijskom učinku. Prva skupina uključuje spojeve koji utječu na prijenos angiogenih signala endotelnim stanicama (antagonisti endotelnih faktora rasta, inhibitori proizvodnje angiogenih faktora, migracija endotelnih stanica), a drugi - spojevi koji utječu na proliferaciju endotelnih stanica. Najperspektivniji antiangiogeni lijekovi kao što su marimastat, batimastat - inhibitori matričnih metaloproteinaza, SU 6661.

Valja napomenuti da se posljednjih godina značajno povećalo naše znanje o biološkim procesima koji su uključeni u formiranje novih mikrovalova u tumoru. I premda se još uvijek formiraju prognostička i terapijska načela, napredak u razumijevanju patofizioloških mehanizama neoangiogeneze u tumorima već se uvodi u kliničku praksu.

Razina timidilat sintetaze u tumoru smatra se jednim od najučinkovitijih markera otpornosti na lijekove i prognoze CRC-a. Enzim je neophodan za sintezu DNA i katalizira metilaciju deoksiuridin monofosfata u deoksitimidin monofosfat kao kofaktor za 5,10-metilentetrahidrofolat (5,10-CH2FH4). Poznato je da 5-fluorouracil (5-FU), jedan od najčešće korištenih antimetabolita u liječenju gastrointestinalnih tumora, kada se daje pacijentu, formira 5-fluoro-2'-deoksiuridin-5'-monofosfatne oblike koji se kovalentno vežu za timidilat sintetazu, blokirajući tako Proces sinteze DNA u tumoru. Proučavanje pokazatelja ekspresije timidilat sintetaze u tumora bolesnika s CRC-om omogućilo je da se smatra nezavisnim prognostičkim čimbenikom u ovoj kategoriji bolesnika. Istodobno, 10-godišnja stopa preživljavanja bila je značajno niža kod pacijenata u kojima je otkrivena tumorska ekspresija enzima.

Na temelju retrospektivne multivarijatne analize i visokog stupnja pouzdanosti rezultata, po definiciji, u ekspresiji timidilat sintetaze u tumorima, ovaj se marker može koristiti u klinici kao neovisni faktor predviđanja za lokalnu recidivnost, udaljene metastaze, razdoblje bez relapsa i ukupno preživljavanje bolesnika s RTK.

Najbolja prognoza bila je za bolesnike s TRK s niskom ekspresijom timidilat sintetaze u primarnom tumoru. Istovremeno, istraživači su uvjerljivo pokazali da se nijedan drugi prognostički čimbenik, uključujući dob, spol, stupanj diferencijacije tumora, ekspresija p53, ne može smatrati neovisnim markerima prognoze, osobito recidivom ove bolesti.

Razina ekspresije timidilat sintetaze u slučaju generaliziranog ili rekurentnog CRC može biti marker osjetljivosti tumora na 5-FU. Češće, najviše razine ekspresije enzima nađene su u abdominalnim metastazama CRC-a (82%) u usporedbi s metastazama tumora u jetri (47%). Vjeruje se da to treba uzeti u obzir pri predviđanju osjetljivosti diseminiranih oblika tumora na 5-FU i pojedinačno mijenjanje strategije kemoterapije u bolesnika.

Također je pokazano da ekspresija timidilat sintetaze i timidin fosforilaze u tumorima pacijenata s netretiranim CRC-om ne samo da ima prognostičku vrijednost u izboru 5-FU kemoterapije zajedno s proliferacijskim markerima kao p53 i Ki-67, već također korelira s pokazateljima bez bolesti i općeg preživljavanja. U isto vrijeme, aktivnost tih dvaju enzima proučavana je biokemijskom metodom u svježe zamrznutim uzorcima tumora, a njihova ekspresija je uspoređena pomoću imunohistokemijske metode u parafinskim dijelovima zajedno s p53 i Ki-67. Utvrđena je značajna korelacija između indeksa enzimske aktivnosti timidin fosforilaze i aktivnosti vezanja 5-fluoro-2'-dezoksisiridin-5'-monofosfata (5-FU metabolita). Postalo je poznato da je aktivnost timidilat sintetaze i timidin fosforilaze usko povezana s procesima angiogeneze i proliferacije u CRC. Istovremeno, ekspresija VEGF-a značajno korelira s aktivnošću timidin fosforilaze i indeksom Ki-67 u tumoru, kao i s trajanjem perioda bez relapsa.

Kada se proučava dihidropirimidin dehidrogenaza, prvi enzim koji metabolizira 5-FU u 5-fluorodihidrouracil, pronađeno je da se indeks ekspresije ovog enzima u tumoru može koristiti kao marker za procjenu osjetljivosti CRC na 5-FU.

Visoka aktivnost inducirane sintetaze dušikovog oksida može poslužiti kao marker agresivnijeg protoka CRC.

Predlaže se uporaba visoko osjetljive i specifične metode za određivanje aktivnosti telomeraze u epitelu

CRC stanice cirkuliraju u krvi. Aktivnost enzima detektirana je u 72% tumora u fazama C i D (klasifikacija Dukes) CRC. Vjeruje se da se ovaj marker u ovoj minimalno invazivnoj metodi može koristiti u ranoj dijagnozi, prognozi i praćenju bolesnika s TCR.

Utvrđeno je da povećana ekspresija CDC25B fosfataze u CRC stanicama u 43% slučajeva ukazuje na lošu prognozu bolesti. Stoga je za ove bolesnike potrebna adjuvantna terapija. Vjeruje se da CDC25B može poslužiti kao neovisni prognostički marker, pa čak i kontrolni čimbenici kao što su metastaze u regionalnim limfnim čvorovima, promjer primarnog tumora, stupanj njegove diferencijacije i dubina invazije. Štoviše, razina ekspresije CDC25B snažno ukazuje na moguću ranu ponovnu pojavu CRC stupnjeva B i C prema Dukesima.

Nedavno su se pojavile studije koje ukazuju na mogućnost korištenja enzima za sintezu prostaglandina i eikozanoida - ciklooksigenaze-2 (COX-2), također poznatog kao prostaglandin endoperoksid sintetaza - kao marker za ranu dijagnozu i prognozu CRC-a. Eksperimentalni i klinički podaci ukazuju na važnu ulogu COX-2 u patogenezi CRC. Prikazana je odsutnost COX-2 u epitelu normalne sluznice i ekspresije proteina u 40% polipa i 80-90% malignih tumora debelog crijeva, što potvrđuje sudjelovanje COX-2 u neoplastičnim procesima i napredovanju CRC-a. Utvrđena je pozitivna korelacija između ekspresije COX-2 i veličine, stadija tumora prema Dukesovoj klasifikaciji. Povećana ekspresija COX-2 u RTC-u postala je osnova za pokušaje korištenja njezinih inhibitora, osobito nesteroidnih protuupalnih lijekova, kao profilaktičkih sredstava koja sprečavaju razvoj CRC-a i maligniteta polipa kolona. Pokusi na životinjama pokazali su da inhibitori COX-2 imaju zaštitni učinak u kolorektalnoj karcinogenezi. Osim toga, ovi lijekovi spriječili su stvaranje novih polipa i pridonijeli regresiji postojećih u debelom crijevu. S druge strane, podaci iz nekih eksperimentalnih studija upućuju na to da je antitumorski učinak nesteroidnih protuupalnih lijekova također posljedica činjenice da induciraju apoptozu u PTK stanicama i inhibiraju angiogenezu u eksperimentalnim tumorima.

Ostali markeri CRC

Ukratko, usredotočit ćemo se na neke tumorske biljege, čija je uporaba obećavajuća za CRC.

Razina ekspresije MUC1 u tumorima može se koristiti kao marker za procjenu progresije i prognoze CRC.

Inhibitor kinaze P27 (KIP1) ovisan o ciklinu može se koristiti kao marker za otkrivanje ranih faza CRC. Međutim, ne može se koristiti kao marker za rano napredovanje ovih tumora.

Također je nedavno predloženo koristiti novi marker, TA90-IC, koji je prisutan u serumu u obliku cirkulirajućih imunoloških kompleksa, pri procjeni prevalencije RTK. Temelj studije bila je činjenica da je, prema mnogim autorima, razina CEA povećana samo u 70% bolesnika u zajedničkom stadiju bolesti. Udaljene metastaze otkrivene su u 86% ispitanih bolesnika, iako su mnogi od njih klinički imali lokalizirani tumor bez znakova generalizacije tumorskog procesa. Analiza razine gore navedenih biljega pokazala je da je koncentracija TA90-IC porasla u 82,9%, a CEA - samo u 70,2% bolesnika. Kombinacija oba markera omogućila nam je da utvrdimo učestalost tumorskog procesa u 93,5% slučajeva. Istraživači vjeruju da ovaj posao treba nastaviti i dokazati ulogu TA90-IC u skriningu i praćenju napredovanja CRC-a.

Valja napomenuti da je s kliničke točke gledišta najadekvatnije istodobno utvrđivanje samo malog broja komplementarnih pokazatelja koji mogu karakterizirati proliferacijsku aktivnost CRC-a, njezin metastatski potencijal, osjetljivost na različite tipove centralne i lokalne regulacije. Zadatak istraživača koji rade na ovom području je odabrati optimalnu kvantitativno i kvalitativno kombinaciju molekularnih markera u dijagnostici, praćenju i prognozi CRC-a.

4.4.3. Bolesti gušterače, želuca, jednjaka i jetre u raku

U zapadnoj Europi, rak gušterače je otkriven u otprilike 10 slučajeva na 100 000. Oko 90% svih tumora.

Bolesti gušterače su adenokarcinomi kanala, a samo 5% su neuroendokrine neoplazme i acinarni karcinom.

Najčešće korišteni biljeg u dijagnostici raka gušterače je CA 19-9. Specifičnost njegova određivanja varira od 76 do 99%, a osjetljivost - od 69 do 93%. Međutim, povećana koncentracija CA 19-9 u serumu nije specifična samo za adenokarcinom pankreasa. Visoka razina CA 19-9 pronađena je kod drugih bolesti gastrointestinalnog trakta (akutni i kronični pankreatitis, ciroza jetre, upala žučnih putova).

Pokazalo se da samo 55% bolesnika s rakom gušterače s promjerom tumora manjim od 3 cm ima povišenu razinu CA 19-9 (> 37 U / ml). Prema tome, uporaba markera CA 19-9 u dijagnosticiranju raka gušterače, posebice njegovih ranih oblika, je ograničena, budući da se njegova razina povećava čak i kod gore spomenutih benignih procesa u jetri i gušterači. Preporuča se odrediti indikatore CA 19-9 za procjenu prognoze raka gušterače, ali ne i za rutinsku praksu.

U perspektivnim istraživanjima proučavani su i brojni drugi markeri za rak gušterače: CA50, CA242, CA195, DU-PAN 2 mucini, CAM 17.1 / WGA. Međutim, trenutno CA 19-9 treba smatrati “zlatnim standardom” u dijagnostici raka gušterače.

Rak želuca je jedan od najčešćih oblika tumora na svijetu. U zapadnoj Europi njegova se učestalost smanjila u posljednjem desetljeću, dok je u Aziji stopa smrtnosti povećana i iznosi oko 100 na 100 tisuća, au SAD-u 6 pacijenata na 100 tisuća umire od raka želuca.

Tri markera su dovoljno detaljno proučavana za rak želuca: CEA, CA 19-9 i CA 72-4, ali se CA 72-4 smatra najosjetljivijim i specifičnijim. CEA i CA 19-9 imaju istu specifičnost, iako CA 19-9 može biti osjetljiviji od CEA, međutim, nijedan od gore navedenih markera ne može se koristiti u probiru i ranoj dijagnozi raka želuca.

Učestalost raka jednjaka znatno varira. Tako je u središnjoj Aziji incidencija njih 50-100 slučajeva na 100.000, dok je u Europi i SAD-u 2-3 slučaja na 100 tisuća, au 90% karcinoma jednjaka zastupljen je karcinom pločastih stanica i manje od 10% adenokarcinoma.

U usporedbi s drugim gastrointestinalnim tumorima, biokemijski biljezi raka jednjaka nisu dovoljno istraženi. Međutim, vjeruje se da SCC i citokeratini (CYFRA 21-1, TPA, TPS) treba smatrati najboljim markerima u dijagnostici raka jednjaka iz skvamoznog epitela, dok je CA 19-9 preferiran u dijagnostici adenokarcinoma jednjaka. Međutim, tumorski biljezi u dijagnostici tumora jednjaka dobili su malo pozornosti zbog njihove nespecifičnosti.

Još jedno ime za ovu bolest je "maligni hepatom". Takva je dijagnoza postavljena u Zapadnoj Europi s učestalošću od 5 do 10 slučajeva na 100 tisuća, au južnoj Europi manje od 5 slučajeva na 100 tisuća.,

Glavni pokazatelj u dijagnostici hepatocelularnog karcinoma je α-fetoprotein, koji, kada se pregleda, otkriva malene veličine tumora, što pridonosi povećanju postoperativnog preživljavanja u ovoj kategoriji bolesnika. Međutim, treba napomenuti da uloga α-FP u probiru za hepatocelularni adenokarcinom nije određena prospektivnim randomiziranim studijama. S obzirom na vrlo rijetku detekciju ovih tumora u zapadnoj Europi, vjeruje se da probiranje hepatocelularnog karcinoma nije potrebno. Međutim, od 1986. godine preporuča se ultrazvuk jetre svakih 6 mjeseci i određivanje koncentracije α-AF svakih 3 mjeseca u bolesnika pozitivnih za površinski antigen hepatitisa B, kao i onih koji pate od kroničnog aktivnog hepatitisa ili ciroze jetre. Također se vjeruje da pacijenti s upornom infekcijom, posebice pacijenti s virusnim hepatitisom C, također trebaju biti smatrani ugroženima za hepatocelularni adenokarcinom. Dokazano je da je rizik od razvoja ovog tumora kod virusnog hepatitisa C i ciroze jetre 100 puta veći nego kod neinficiranih osoba.

Jedan od važnih problema s primjenom α-FP u diferencijalnoj dijagnozi hepatocelularnog adenokarcinoma su hepatitis i ciroza jetre, u kojoj se također povećava razina tumorskog markera. Stoga, odvajanje fukoziliranog α-OP od normalnog α-OP vezanjem na lektine pomaže u diferencijalnoj dijagnozi gore navedenih bolesti. Identificiranje ovih α-OP frakcija pomaže u diferencijalnoj dijagnozi hepatocelularnog karcinoma. Osim toga, kod benignih bolesti, razina α-FP može se privremeno povećati, dok je kod hepatocelularnog karcinoma konstantno povišen u krvnom serumu. Stoga, određivanje α-OP nekoliko puta u razdoblju od 2-3 tjedna omogućuje da se isključe njegove lažno pozitivne vrijednosti. Osim toga, nedavno se pojavio novi marker u dijagnostici hepatocelularnog adenokarcinoma - des-gama-karboit protrombina (DCP), također poznatog kao PIVKA II (protein induciran nedostatkom vitamina K). Kombinacija ovog markera s α-FP omogućuje identificiranje hepatocelularnog karcinoma u 86% i solitarnog tumora u 78,3%, au tim slučajevima jedan od tih markera će biti pozitivan.

4.4.4. NEFORMACIJE ŽIVOTNOG REPRODUKTIVNOG SUSTAVA

Genitalne neoplazme kod žena čine 15% svih tumora, a raspodjeljuju se prema stupnju raspada u sljedećem redoslijedu: rak tijela maternice, jajnici i cerviks. Međutim, u strukturi mortaliteta, rak jajnika je na prvom mjestu, nakon čega slijedi rak grlića maternice i maternice. Na primjer, u SAD-u godišnje se registrira 20 tisuća novih slučajeva raka jajnika i 12 tisuća smrti od ovog tumora. Etiologija bolesti je nepoznata, međutim, anovulacija, uporaba određenih kontraceptiva, kao i obiteljska osjetljivost smatraju se faktorima rizika.

Više od 90% tumora jajnika ima epitelnu prirodu, tj. nastaju iz koelomnog epitela. Epitelni tumori jajnika klasificirani su na temelju staničnog tipa: serozni, mucinozni, endometrioidni, bistri, miješani epitelni, nediferencirani, skvamozni. Najčešće se rak jajnika razvija iz seroznih stanica.

Najbolji marker za epitelni karcinom jajnika je mucin - CA 125. Tijekom menstruacije, razina markera kod žena može se povećati na 100 kU / l i više. Razina CA 125 raste u gotovo 80% bolesnika s epitelnim tumorima jajnika, no samo polovica pacijenata s I. stadijem raka jajnika prema međunarodnoj (FIGO) klasifikaciji ove bolesti pokazuje visoke stope tumorskog markera. Nedovoljna osjetljivost u ranoj dijagnozi, kao i otkrivanje povišenih vrijednosti CA 125 u raznim benignim tumorima i drugim adenokarcinomima, ne dopuštaju korištenje ovog pokazatelja kao markera za rano otkrivanje raka jajnika. Uz razinu drugih markera (α-OP, hCG, hCGb), razina CA 125 može se povećati s tumorima iz stanica zametnih stanica.

Prognoza raka jajnika ovisi uglavnom o stadiju bolesti. Probiranje CA 125 je neosjetljivo, a samo 50% bolesnika s I. stadijem bolesti ima povišenu razinu markera, zbog čega se taj marker ne preporučuje za otkrivanje sporadičnih slučajeva bolesti. Međutim, određivanje CA 125 u kombinaciji s ručnim rektovaginalnim pregledom zdjeličnih organa i transvaginalne ultrasonografije može biti važno u ranom otkrivanju raka jajnika.

Multicentrična prospektivna studija žena u postmenopauzi s tumorima u maloj zdjelici i usporedba transvaginalne ultrazvuke, ručnog pregleda zdjeličnih organa i određivanja CA 125 (prag CA 125 35 kU / l) pokazala je da je dijagnoza potvrđena tim metodama na 77, 76 i 74%, Osim toga, korištenjem regresijske analize pokazano je da je, u usporedbi s ultrazvukom, CA 125 osjetljiviji, ali je dijagnostička vrijednost lošija od one u ručnoj studiji. Tumori se ne otkrivaju kombinacijom negativnih rezultata triju metoda. Određivanje razine CA 125 prije operacije može od liječnika potaknuti moguću količinu kirurških koristi.

Poznato je da su tradicionalni prognostički čimbenici u bolesnika s rakom jajnika stadij bolesti, stupanj diferencijacije i histološki tip tumora, veličina rezidualnog tumora nakon palijativne citoreduktivne kirurgije. U isto vrijeme, multicentrične studije su pokazale da je razina CA 125 u serumu bolesnika nakon 1., 2. i 3. tečaja kemoterapije jedan od najvažnijih prognostičkih čimbenika ranog razvoja.

mu je povratak bolesti. Produženi poluživot CA od 125 ili manje od 7-strukog smanjenja razine tumorskih markera u prvim mjesecima nakon liječenja ukazuje na loš ishod. Daljnje studije su pokazale da je koncentracija CA 125> 70 kU / l prije trećeg ciklusa kemoterapije najvažniji čimbenik u predviđanju progresije bolesti u sljedećih 12 mjeseci.

CA 125 pri praćenju bolesnika s rakom jajnika omogućuje otkrivanje rane recidiva. Međutim, u literaturi nema podataka koji bi pokazali da pravovremeno otkrivanje recidiva bolesti može poboljšati stope preživljavanja. Povećanje CA 125 ukazuje na rezidualnu bolest u 94,8% slučajeva, međutim, gotovo polovica bolesnika s normalnim vrijednostima markera također je bolovala (tumorski čvorovi) prema "drugi-pogled" -lazarotomiji. Razine CA 125 su povećane u serumu od 25% bolesnika koji imaju samo mikroskopske znakove bolesti i kod 79% bolesnika čiji je promjer recidivirajućeg tumora veći od 1 cm tijekom laparotomije.

Rak dojke

Rak dojke (BC) je jedan od glavnih uzroka smrti žena u zapadnoeuropskim zemljama, a tijekom života žene rizik od ovog tumora je 12,2%, a rizik od smrti od 3,6%. Postoji mnogo čimbenika koji su povezani s rizikom od raka dojke: genetski i obiteljski čimbenici, hormonski (rana menarha, kasna menopauza, kasna prva trudnoća) čimbenici, prehrana, benigne bolesti dojke (uglavnom povezane s atipičnom hiperplazijom).

Trenutno su poznati brojni tumorski markeri za rak dojke: MIS-1 (CA 15-3), CEA, onkoproteini, citokeratini. Najčešće korišteni su CEA i CA 15-3. Postoje i drugi članovi obitelji MIS-1 gena: MSA, CA 519, BR27-29, BRMA. Svi oni imaju jednaku osjetljivost i specifičnost, kao i SA 15-3. Prema tome, upotreba više markera ne dodaje odmah podatke dobivene korištenjem CA 15-3. Brojni markeri, kao što su citokeratini (TPA, TPS, CYFRA 21-1) i topivi onkoproteini (c-erbB-2), trenutno se intenzivno proučavaju i prolaze kliničku procjenu.

Osjetljivost tumorskih biljega u bolesnika s ranim rakom dojke vrlo je niska (15-35%), pa je njihova uporaba u dijagnostici

često teško. Naravno, rezultirajuće niske vrijednosti markera ne isključuju prisutnost primarnih i metastatskih žarišta. S druge strane, visoka razina markera u bolesnika s rakom dojke gotovo u potpunosti ukazuje na prisutnost generalizacije tumora i pojedinačnih metastaza.

Visoke razine CEA, CA 15-3 i drugih markera obitelji MIS-1 jasno su povezane s stadijem raka dojke, veličinom tumora i uključivanjem regionalnih limfnih čvorova u tumorski proces. Ali još nije jasno jesu li ti markeri neovisni prognostički čimbenici. Štoviše, nije poznato da li će uporaba takvog tumorskog markera kao indikatora rane recidivacije bolesti dovesti do povećanja preživljavanja bolesnika bez relapsa.

U slučaju radikalnog liječenja raka dojke, serijska određivanja CEA i CA 15-3 mogu se također pokazati u ranoj dijagnozi relapsa. Ti tumorski biljezi unutar 2-18 mjeseci (prosječno 5,2 mjeseca) nađeni su u 40-60% bolesnika s rekurentnim rakom dojke prije pozitivnog odgovora prema rezultatima kliničkih, instrumentalnih i radioloških metoda (rendgenski snimci prsnog koša, ultrazvuk jetre, skeniranje skeleta). Dinamičko određivanje razina CEA i CA 15-3 smatra se vrlo osjetljivim testom u ranoj dijagnozi metastaza kostiju i jetre te, osim toga, smanjuje učestalost pacijenata s izotopskim skeniranjem i dijagnostičkim postupcima radioizotopa.

Tkivni biljezi kod raka dojke

Za razliku od klasičnih tumorskih markera, određenih u serumu, stanični ili tkivni markeri su tipizirani izravno u tumorskom tkivu. Većina njih karakterizira određena biološka svojstva tumora, specifičnosti njegovog ponašanja i regulacije, primjerice hormonsku osjetljivost ili sklonost invaziji i metastazama. Za neke molekularne markere još nije ustanovljena specifična biološka funkcija. Glavni značaj takvih markera leži u činjenici da oni karakteriziraju biološke značajke svakog specifičnog tumora i pomažu u predviđanju i individualizaciji liječenja bolesti.

U kartici. 4.10 prikazani su biološki značajni pokazatelji koji su aktivni ili potencijalni tkivni markeri karcinoma dojke.

Tablica 4.10. Glavne skupine prognostičkih markera tkiva / stanica za rak dojke

U općem slučaju, definicija molekularnog markera u raku dojke može imati tri praktična rezultata: 1) identificiranje među pacijentima s ranim stadijima rizičnih skupina raka koje zahtijevaju dodatno liječenje, kao i onih koje nisu predmet adjuvantne terapije; 2) određivanje osjetljivosti na pojedine vrste terapije i individualizacija shema adjuvantnog liječenja pacijenata zajedničkim procesom; 3) razvoj novih lijekova.

Receptori steroidnih hormona, ponajprije receptori estrogena (ER), bili su među prvim pokazateljima koji su uključeni u praksu liječenja indikatora raka dojke koji se odnose na kategoriju staničnih markera. Nešto kasnije, osim njih, identificirani su i receptori receptora progesterona (RP).

Prisutnost ER u primarnom tumoru dojke ukazuje na njezinu potencijalnu osjetljivost na terapijske mjere usmjerene na uklanjanje izvora estrogena iz tijela ili za suzbijanje njihovih učinaka (ovariektomija, uporaba antiestrogena).

RP je od interesa kao molekularni marker raka dojke, ne samo zato što je prvi element odgovora stanice na progestine, određuje osjetljivost na odgovarajuće lijekove, nego i zato što je njegova sinteza u stanicama raka dojke inducirana estrogenom. Stoga, prisutnost RP može ukazati na funkcionalnu aktivnost ER.

Trenutno, različite klinike i laboratoriji koriste tri relativno ekvivalentne metode za određivanje statusa receptora raka dojke: radioligand - procjena sposobnosti vezivanja receptora u citosolu tumora; enzimski imunotest - određivanje koncentracije proteina imunoreaktivnog receptora u istim citosolima; imunohistokemijski specifično bojanje tumorskih sekcija pomoću antitijela za receptorske proteine. Prednost prve dvije metode je kvantitativna, što omogućuje objektivizaciju kriterija za procjenu statusa receptora. Metoda radioliganda također omogućuje procjenu funkcionalne aktivnosti receptora u jednoj od prvih faza njegove interakcije s hormonom, što čini predviđanje osjetljivosti hormona pouzdanije nego u određivanju imunoreaktivnih proteina.

S druge strane, iako je imunohistokemijska metoda po naravi polu-kvantitativna, ona ima važnu zaslugu, naime, da kada se boji dijelovi mogu jasno

kako bi se odredila pripadnost receptora tumorskim stanicama. Pri korištenju biokemijskih metoda ta mogućnost nije prisutna. Osim toga, ova metoda omogućuje rad s arhivskim materijalom - parafinskim blokovima, pa čak i gotovim naočalama, što ga čini jedinom mogućom opcijom kada je potreba za istraživanjem receptora steroidnih hormona nastala ili je realizirana dugo vremena nakon operacije.

Poznato je da varijanta karcinoma dojke ovisna o hormonima, kada su tipizirani oba ili barem jedan od steroidnih hormonskih receptora, karakterizira povoljan tijek, a postoperativni period kod ovih bolesnika je bolji nego u slučaju receptor-negativnih tumora. Ipak, u praktičnom kliničkom radu, rezultati određivanja receptora steroidnih hormona uglavnom se koriste u odabiru pacijenata osjetljivih na endokrinu terapiju.

Receptori faktora rasta. Ova skupina također uključuje same čimbenike rasta - proteine i male polipeptide koje proizvode same tumorske stanice i druge komponente tumorskog tkiva (fibroblasti, makrofagi i limfociti infiltriraju tumor, endotelne stanice) i stimuliraju rast proizvodnih stanica (autokrini mehanizam) ili susjedne stanice (parakrine) mehanizam).

Različiti faktori rasta su uključeni u autokrinu i parakrinu regulaciju proliferacije stanica raka dojke: peptidi EGF skupine (α-transformirajući faktor rasta, amfiregulin, itd.) Koji interagiraju sa zajedničkim receptorom, faktorima rasta sličnim inzulinu (IGF), somatostatinu itd. u tumorima u bolesnika s rakom dojke. Prisutnost EGFR u tumoru mliječne žlijezde, posebno u odsutnosti receptora steroidnih hormona, ukazuje na nepovoljnu prognozu bolesti čak iu ranim stadijima i otpornost na endokrinu terapiju. Postoje dokazi da prisutnost IGF receptora i somatostatin receptora ukazuje na povoljniju prognozu karcinoma dojke.

Ipak, zbog dvosmislenosti rezultata dobivenih od različitih autora, nijedan od pokazatelja koji karakterizira osjetljivost raka dojke na auto i parakrine regulatore još nije ušao u rutinsku kliničku praksu, kao što je proučavanje razine receptora steroidnih hormona. Međutim, može se očekivati da će se u bliskoj budućnosti interes za proučavanje EGFR u raku dojke ponovno povećati, zbog činjenice da već u kliničkoj fazi

Ispitivanja, lijekovi koji specifično djeluju na EGFR, monoklonska antitijela na receptor i inhibitori interne tirozin kinaze EGFR, provode prvi stupanj prijenosa mitogenog signala.

Valja napomenuti da se do sada za "zlatni standard" u istraživanju difrakcije X-zraka smatra da je određivanje radioliganda u membranskoj frakciji tkiva pomoću 125 I-označenog EGF-a i naknadnog odvajanja hidroksil-apatita.

Određeni uspjeh u području praktične uporabe markera povezanih s REFR-ovisnom regulacijom rasta raka dojke već je postignut nakon pojave lijeka Herceptin, koji je humanizirano antitijelo na HER2 / neu, jednog od receptora obitelji ErbB, kojoj pripada i REFR.

Obitelj receptora za tirozin kinazu - proizvodi od onkogena c-erbB, koji uključuju četiri transmembranska receptora sa sličnom strukturom, REFR (ErbB-1), ErbB-2 (HER2 / neu), ErbB-3 (HER3) i ErbB-4 (HER4) je jedan od najvažnijih regulatornih sustava za prijenos mitogenog signala.

Osim strukture, ErbB familija receptora se razlikuje u relativnoj specifičnosti i afinitetu za različite uobičajene ligande. Glavna značajka svih receptorskih tirozin kinaza je transmembranska lokalizacija i potreba za interakcijom s odgovarajućim ligandom (aktivirajućim faktorom) za ostvarivanje kinazne aktivnosti i naknadnih bioloških učinaka. Nakon aktivacije kao posljedice vezanja liganda i dimerizacije, unutarnja receptorska tirozin kinaza se aktivira i dobiva sposobnost fosforiliranja i samog receptora i drugih staničnih proteina uključenih u prijenos mitogenog signala. Receptori obitelji ErbB mogu tvoriti i homo-i heterodimere, au mnogim slučajevima su najaktivnije heterostrukture s učešćem receptora HER2 / neu, koje nemaju vlastiti ligand.

Prema tome, HER2 / neu je jedinstveni predstavnik razmatrane obitelji transmembranskih tirozin kinaza, budući da, bez vlastitog liganda i bez interakcije s bilo kojim od poznatih faktora rasta koji aktiviraju srodne receptore, ipak je ključni element u prijenosu mitogenih signala svih EGF- sličnih peptida i neophodan je za uspješno funkcioniranje cijelog sustava.

Što se tiče prognostičke vrijednosti prekomjerne ekspresije ili pojačanja gena c-erbB-2, unatoč gigantskom materijalu (više od 12.000 bolesnika s rakom dojke ispitano je u različitim laboratorijima širom svijeta), ne postoji konsenzus o prediktivnoj vrijednosti HER2 / neu. Neki autori su zabilježili njegov štetan učinak na preživljavanje pacijenata bez raka dojke bez metastaza u limfnim čvorovima, dok drugi istraživači ne nalaze pouzdan odnos između tih pokazatelja. Objavljeni podaci pokazuju da tumori s pojačanim HER2 / neu genom ne reagiraju dobro na hormonsku terapiju, ali su osjetljivi na kasniju kemoterapiju. Trenutno se također smatra da pacijentima s HER2 / neu-pozitivnim tumorima treba preporučiti intenzivnije kemoterapijske režime nego bolesnici s tumorima koji nemaju povećanu ekspresiju tog onkogena.

Sustav aktivacije plazminogena. Sposobnost metastaziranja i invazije je jedno od temeljnih svojstava malignih tumora, čiji je najvažniji mehanizam razaranje okolne bazalne membrane i izvanstaničnog matriksa proteazama povezanim s tumorima. Ove proteaze su također uključene u neoangiogenezu, doprinoseći proliferaciji novih krvnih žila u tumoru.

Središnje mjesto zauzima proteolitička kaskada aktivacije plazmina u tumorskom tkivu. Vjeruje se da plazmin, koji može smanjiti razinu izvanstaničnih matričnih glikoproteina i aktivirati neke prometalne proteaze, kao što je kolagenaza tipa IV, igra ključnu ulogu u lokalnom širenju tumora i stvaranju metastaza u udaljenim organima i tkivima. U višestupanjskom lancu proteaza koje dovodi do uništenja ekstracelularnog matriksa, urokinazni tip plazminogen aktivatora (uPA) zauzima ključnu poziciju. UPA receptor koji se nalazi na površini stanice također igra važnu ulogu, budući da se sposobnost uPA da aktivira plazminogen povećava kada se veže na nju. Općenito, proces formiranja plazmina je cikličko pojačanje regulirano mehanizmom povratne veze.

Osim uPA, aktivator tkivnog tipa (tPA) također je uključen u aktivaciju plazminogena, ali čini se da je njegova uloga u razvoju tumora suprotna i smanjuje se uništavanje tumorskih stanica.

stanice i zaštitu okolnih tkiva. Aktivnost IRA i tPA inhibirana je s dva inhibitora proteina koji pripadaju serpinskoj obitelji, PAI-1 i PAI-2. Na temelju eksperimentalnih i kliničkih podataka, tijekom rasta tumora, dva inhibitora aktivatora plazminogena također igraju različitu ulogu: PAI-1 štiti tumorske stanice od samouništenja, a PAI-2 inhibira proteolitičke procese u izvanstaničnom matriksu.

Različite komponente aktivacijskog sustava plazminogena u tkivu dojke mogu biti smještene i na samim tumorskim stanicama i na stromskim fibroblastima, limfocitima i makrofagima i endotelnim stanicama koje infiltriraju tumor. U tom smislu možemo pretpostaviti da je proces aktivacije plazminogena prvenstveno parakrina.

Razina i omjer ekspresije komponenata aktivacijskog sustava plazminogena u tumorskom tkivu može poslužiti kao pokazatelj metastatske i invazivne tumorske aktivnosti, zbog čega je biološki značajan prognostički faktor za maligne tumore ili pokazatelj rizika od maligniteta u benignih neoplazmi. Osim toga, supresija aktivacije plazminogena tipom urokinaze na različitim razinama može postati jedan od pristupa u razvoju novih tipova antimetastatske terapije, za što je potrebna klinička upotreba kako bi se identificirale skupine pacijenata potencijalno osjetljivih na takvo liječenje. Razvoj takvih lijekova već se vrlo aktivno provodi u eksperimentalnim laboratorijima i farmaceutskim tvrtkama, što čini istraživanje njihovih ciljnih proteina u humanim tumorima posebno relevantnim.

Najprikladnija metoda za procjenu razine ekspresije komponenti aktivacijskog sustava plazminogena trenutno se smatra kvantitativnim enzimskim imunotestom za određivanje njihove koncentracije u citosolima tkiva. Nažalost, još uvijek nisu uspostavljeni jedinstveni pragovi, iako se već provode međunarodna kooperativna istraživanja u tom smjeru.

Faktor rasta vaskularnog endotela. Posljednjih se godina mnogo pažnje posvećuje problemu neoangiogeneze - stvaranju novih krvnih žila - u malignim tumorima. Za razliku od vaskulogeneze, angiogeneza je proces odvajanja novih kapilarnih procesa od postojećih krvnih žila. Činjenica da se tumor ne može razvijati i rasti bez formiranja

ima veliku mrežu kapilara koje stanicama daju kisik i hranjive tvari. Proučavanje molekularnih mehanizama angiogeneze omogućilo je prelazak s mikroskopske procjene gustoće krvnih žila u tumorskom tkivu na proučavanje specifičnih molekula uključenih u regulaciju stvaranja i rasta novih krvnih žila. Najvažniji pozitivni regulator angiogeneze je nesumnjivo VEGF, koji se naziva i faktor vaskularne permeabilnosti. Jedinstvenost ovog faktora leži u činjenici da, za razliku od svih drugih faktora rasta, on je mitogen samo u odnosu na endotelne stanice. Dokazano je da VEGF ima ključnu ulogu u neoangiogenezi kod raka dojke.

Rezultati brojnih retrospektivnih kliničkih studija objavljenih nedavno pokazuju da je ekspresija VEGF-a u raku dojke ključna za prognozu bolesti, a također utječe na osjetljivost tumora na hormonalno i lijekovito liječenje. Ero visoka razina ukazuje na lošu prognozu i za rani i za obični rak dojke. Osim toga, aktivno se razvijaju i istražuju novi lijekovi s antiangiogenim svojstvima, a procjena aktivnosti angiogeneze ovisne o VEGF može biti osnova za njihovu ciljanu uporabu.

Rak grlića maternice

Gotovo u cijelom svijetu, rak grlića maternice nakon raka dojke je drugi najčešći uzrok smrti od tumorskih bolesti. Glavni čimbenici rizika za ovu bolest su socioekonomski, rani brak, veliki broj spolnih partnera, kao i infekcije uzrokovane humanim papiloma virusom (HPV) (tipovi 16, 18, 31 i 45). Pokazatelji 5-godišnje preživljavanja ove bolesti je oko 70%. Međutim, ako se novotvorina otkrije u ranom stadiju, stopa preživljavanja od 5 godina povećava se na 90%. Valja napomenuti da je 90% tumora cerviksa karcinom skvamoznih stanica, a od drugih histoloških tipova adenokarcinom i karcinom skvamoznih stanica. Sarkomi ili neuroendokrini rak se vrlo rijetko nalaze.

U dijagnozi karcinoma pločastih stanica cerviksa se koristi kao tumorski marker SCCA antigen - protein (molekularna težina 48 kD) s jakom homologijom obitelji inhibitora proteaze, tzv. Osjetljivost metode u I. stadiju bolesti je manje od 30%, au IV. Stupnju - 90%. međutim

SCCA ekspresija se također može povećati kod drugih tumora skvamoznih stanica (rak pluća, tumori glave i vrata, rak jednjaka i vagine), benigni tumori kože (psorijaza, ekcem), pluća (sarkoidoza), jetra i bubrezi. Ovaj tumorski marker se ne koristi u probiru.

Za probiranje raka grlića maternice, Papanicolau program, instrumentalne i morfološke dijagnostičke metode koje dijagnosticiraju predinvazivne tumore, kao što su karcinom in situ (CIS) i intraepitelna neoplazija cerviksa (CIN), predložene su širom svijeta. Razvoj ovih procesa unutar 10-15 godina može prethoditi raku grlića maternice. U dijagnostici ranih stadija SCCA se ne koristi, jer razina tumorskog markera ovisi o volumenu primarnog tumora, stadiju i uključenosti limfnih čvorova u tumorskom procesu. Povišene razine SSCA prije liječenja mogu biti neovisni čimbenik u procjeni metastatske lezije regionalnih limfnih čvorova.

Visoke vrijednosti markera prije liječenja ukazuju na lošu prognozu u bolesnika s karcinomom skvamoznih stanica cerviksa. Neke studije su pokazale da se SCCA može koristiti kao neovisni prognostički čimbenik za rak vrata maternice. U cervikalnim adenokarcinomima, CA 125 je korisniji kao prognostički faktor, ali ne i SCCA.

SCCA marker određuje da otkrije ranu recidiv karcinoma cervikalnih skvamoznih stanica, kao i praćenje prije neoadjuvantne terapije i prije rekurentne terapije tumora. U tim slučajevima korelacija je 80%, što je od velikog kliničkog značaja u odabiru bolesnika za naknadnu radioterapiju ili kirurško liječenje.

Karcinom endometrija čini 50% svih malignih tumora urogenitalnog trakta kod žena, au 80% slučajeva se nalazi tijekom pregleda maternice. Preživljavanje u I. stupnju je 80%, na IV - 10%. U 60-80% slučajeva tumori imaju strukturu adenokarcinoma.

Najčešće, rak endometrija povećava tumorski marker CA 125: u fazi bolesti do 22%, au fazi III-IV - do 80%, razina markera je iznad 35 kU / l. Ne postoji tumorski marker za probiranje za rano otkrivanje raka endometrija. Morfološka istraživanja smatraju se tradicionalnom metodom.

dijagnostika karcinoma endometrija i uzorci tkiva dobiveni nakon kiretiranja sluznice maternice.

U praćenju karcinoma endometrija, CA 125 se smatra najboljim pokazateljem, au 60% bolesnika s ranim ponovljenim pojavljivanjem tumora utvrđeno je da je porast seruma CA 125.

4.4.5. RAK Pluća

U ekonomski razvijenim zemljama, muška populacija malignih neoplazmi karcinoma pluća je 21% u strukturi ukupne smrtnosti. Rak pluća je prototip tumora induciranog kemijskim karcinogenima. Nađena je bliska povezanost između razvoja raka pluća i pušenja cigareta, ali ne i svi pušači razvijaju rak, već samo 5-10%, što ukazuje na važnu ulogu genetske predispozicije kod tih bolesnika. U gotovo 50% slučajeva može se preporučiti kirurško liječenje tijekom početne dijagnoze, ali samo u 70% njih tumor se može resektirati.

Glavni histološki tipovi raka pluća su: skvamozne stanice (PRL), adenokarcinom, karcinom velikih stanica i karcinom malih stanica pluća (MRL). Valja napomenuti da se MRL razlikuje od ostalih histoloških tipova tumora pluća po značajkama kliničkog tijeka. Prema tome, svi maligni tumori pluća su podijeljeni na SCLC i na karcinom pluća bez malih stanica (NSCLC), koji su dio heterogene skupine tumora.

Kod raka pluća najčešće se proučavaju sljedeći markeri: neuronski specifična enolaza (HCE), CEA, 19 citokeratin fragment (CYFRA 21-1), skvamozni antigen (SCC), CA 125, tkivni polipeptidni antigen (TPA).

Neuron-specifična enolaza prvi put je pronađena u neuronima mozga i perifernom živčanom sustavu. HSE je izoenzim citoplazmatske glikolitičkog enzima enolaze (2-fosfo-D-glicerat hidrolaza, EC 4.2.1.11) i sastoji se od dva gotovo identična polipeptidna lanca γ tipa, molekularna težina svakog je jednaka 39,000 D. U mozgu, zajedno s izoformom - dimer iz podjedinica α-tipa i hibridni izoenzim αγ, koji imaju sličan afinitet za supstrat - 2-fosfoglicerinsku kiselinu. Enolaza koja je sadržavala ovu y-podjedinicu (α-y i y-y) nazvana je HCE. Izoforme mogu sintetizirati glijalne moždane stanice, kao i većina somatskih stanica.

tkiva. Sam se enzim sintetizira u središnjim i perifernim neuronima i malignim tumorima neuroektodermalnog podrijetla (SCR, neuroblastomi, intestinalni karcinoidi).

Pokazano je da je gornja granica HSE kod zdravih ljudi 12,5 ng / ml. Uzimajući u obzir, međutim, da su koncentracije do 20 ng / ml

i više, i može se pojaviti kod benignih bolesti pluća, za kliničku dijagnozu, viša razina vrijednosti praga (> 25 ng / ml) je poželjna. Povećanje aktivnosti HCE u serumu detektirano je u 40-70% primarnog

bolesnika s IRL-om i 83-98% bolesnika s čestim stadijem bolesti.

Prema podacima Centra za rak Memorial Sloan Kettering (SAD), učestalost povećanja aktivnosti HCE u serumu bolesnika s SCR-om ovisi o učestalosti tumorskog procesa: u fazi I-II osjetljivost testa je 39%, u fazi III-IV - 87%. Treba napomenuti da u analizi dijagnostičkog značenja mnogi autori identificiraju relativno visoku specifičnost u usporedbi s drugim markerima. Tako se aktivnost u emfizemu povećavala samo u iznimnim slučajevima, za razliku od koncentracije CEA koja se povećavala u 7-36% opažanja. Rezultati istraživanja pokazuju da je HCE sasvim primjenjiv kao tumorski marker izbora, kako u diferencijalnoj dijagnozi, tako iu praćenju učinkovitosti terapije za MRL.

Istodobno je utvrđeno povećanje aktivnosti HCE u serumu bolesnika s tuberkulozom (27,3%), kao i kod bolesnika zaraženih HIV virusom u usporedbi s nezaraženim. Bolesnici s alveolarnim infiltratima ili intersticijskim žarištima u plućima također su imali značajno povišene razine HCE u serumu. Smatra se da je povećanje serumskog HSE u bolesnika s benignim plućnim bolestima povezano s lokalnom hipoksijom. Prikazane rezultate treba uzeti u obzir pri analizi HCE u bolesnika s karcinomom pluća iu opstruktivnim plućnim procesima.

Valja napomenuti da je, s obzirom na značajnu heterogenost karcinoma pluća, posebice varijantu malih stanica, moguće uočiti značajnu dijagnostičku i prognostičku važnost HCE u usporedbi s drugim tumorskim markerima.

Kancerogeni antigen, predstavljen glikoproteinom molekulske mase od oko 180 kD, također pripada skupini

onkofetalni antigeni, sintetizirani i izlučeni u crijevne stanice embrija i fetusa, kao i neki maligni tumori (rak dojke, želuca, pluća). Prvi put je CEA pronađen u bolesnika s rakom debelog crijeva. Trenutno, spojevi slični CEA također su otkriveni na staničnim membranama u ne-embrionalnim i ne-kanceroznim tkivima. Postoje svi razlozi za vjerovanje da je jetra glavno metaboličko mjesto CEA. Razina CEA u krvnom serumu povećana je u 40-80% bolesnika s malignim neoplazmama endodermalnog podrijetla, u 20-30% s drugim oblicima raka i 10-20% s benignim tumorima. Najveća osjetljivost CEA i najviše koncentracije markera nađene su u adenokarcinomu i raku velikih stanica pluća.

Antigen serumskog skvamoznog karcinoma je protein molekulske mase 48 kDa, koji je sličan serpinima (inhibitorima proteaze). Oznaka se koristi u dijagnostici karcinoma pločastih stanica u različitim organima (rak vrata maternice, jednjaka, pluća, tumora glave i vrata). Više od 70% bolesnika s PRL ima povišenu razinu. Međutim, samo u 26.1% razine tumorskog markera povećava se u serumu s adenokarcinomom pluća i ne otkriva se SCR-om. U 87,8% bolesnika s ranim relapsom PRL-a zabilježena je visoka razina SCC u serumu. Prepoznavanje izražavanja SCC u imunohistokemijskom istraživanju tumora pluća je od velike praktične važnosti.

Tkivni polipeptidni antigen je polidisperzijska mješavina citokeratina 8, 18 i 19 (molekulska masa od 20 do 45 kD), koja može polimerizirati u otopini da formira oligomere. Aktivnost TPA ovisi o aminokiselinskoj sekvenci i položaju argininskog ostatka. Obično se nalazi u visokim koncentracijama u placenti i tkivu fetusa. TPA je lokaliziran na plazmatskoj membrani i endoplazmatskom retikulumu tumorskih stanica, proizvodi se proliferirajućim stanicama i spontano se oslobađa u okoliš. TPA se nalazi u gotovo svim malignim tumorima.

Fragment citokeratina 19. Značaj citokeratina za diferencijaciju fiziološkog i patološkog tkiva odavno je poznat u histopatologiji. Citokeratini su netopljivi stanični proteini, a više od 20 ih je sada dobro karakterizirano s monoklonskim antitijelima. Nasuprot tome

iz cijele molekule, fragmenti citokeratina su topljivi u serumu. U testu za tumorski marker CYFRA 21-1 koriste se dva tipa monoklonskih antitijela (Ks 19.1 i BM 19.21) za detekciju fragmenta citokeratina 19 molekulske mase 30 kD. Gornja granica normalne vrijednosti kod zdravih ljudi je 2,3 ng / ml. Test CYFRA 21-1 ima dobru specifičnost za benigne bolesti pluća, razina praga je 3,3 ng / ml. Marker ima visoku osjetljivost u dijagnostici NSCLC.

Nema povezanosti CYFRA 21-1 s pušenjem. Pokazalo se da je razina CYFRA 21-1 ista u serumu bolesnika s ne-malignim plućnim bolestima, SCLC i kontrolnom skupinom. U isto vrijeme, značajno više razine CYFRA 21-1 zabilježene su u bolesnika s NSCLC, adenokarcinomom i PRL. Prikazani podaci potvrdili su visoku osjetljivost i specifičnost CYFRA 21-1 u diferencijalnoj dijagnozi malignih i nemalignih plućnih bolesti, kao i između MRL i NSCLC. Bolesnici s metastazama u limfnim čvorovima N2 i N3 imaju najvišu razinu CYFRA 21-1 u serumu (5,6 ng / ml) (granice fluktuacije 3,2-11,5 ng / ml) u usporedbi s bolesnicima s N0 i N1 (3,9-10 ng / ml) (Mann-Whitney U-test; p = 0,0373).

Kod svih vrsta raka pluća, CYFRA 21-1 ima najveću osjetljivost (57,7%) u usporedbi s CEA (45,3%) i SCC (22,6%). Iako je kombinacija CYFRA 21-1 i CEA za dijagnozu NSCLC, osjetljivost i točnost povećana na 75,4 odnosno 78,1%, ali se specifičnost smanjuje na 86,5%.

Japanski istraživači (Sveučilište u Tsukubi) predlažu da se uz citološki pregled odredi razina CYFRA 21-1 u pleuralnoj tekućini kako bi se poboljšala dijagnoza i diferencijalna dijagnoza raka pluća. To je zbog činjenice da je značajno povećanje markera detektirano u pleuralnoj tekućini kod pacijenata s karcinomom pluća (prosječno 84,5 ng / ml) u usporedbi s bolesnicima s benignim tumorima (13,9 ng / ml). Osim toga, razina CYFRA 21-1 u pleuralnoj tekućini bolesnika s PRL značajno se razlikuje od one u pneumoniji, dok CEA ne otkriva takve razlike.

Prilikom određivanja CYFRA 21-1 treba biti svjestan mogućeg povećanja razine do 10 ng / ml u slučaju progresivne benigne bolesti jetre, a osobito u slučaju zatajenja bubrega. Može također doći do onečišćenja uzorka elementima sline

dovodi do značajnog povećanja vrijednosti CYFRA 21-1. U ovom slučaju, rezultat ne utječe na spol, dob, pušenje i trudnoću. Istraživanja svih tipova solidnih tumora pokazala su da je CYFRA 21-1 učinkovit marker za NSCLC i PRL.

U zaključku, razmotrimo neke značajke primjene u klinici markera malignog rasta na primjeru karcinoma pluća.

Prije svega, ne biste trebali koristiti sve gore navedene markere u probiru za asimptomatski rak pluća ili u bolesnika s visokim rizikom razvoja ovog tipa tumora. Primarna dijagnoza i primarno liječenje bolesnika s rakom pluća temelje se na kliničkim i instrumentalnim metodama ispitivanja (klinički, endoskopski, rendgenski, intraoperativni nalaz).

Nadalje, NSE marker treba smatrati iznimno važnim u imunohistokemijskoj dijagnozi tumorske varijante. Često samo određivanje HCE u serumu potvrđuje dijagnozu SCLC.

Koncentracija SCC u serumu> 2 mg / l ukazuje na 95% vjerojatnost otkrivanja NSCLC i 80% karcinoma pločastih stanica.

Kod CA 125 razine iznad 100 U / ml i CEA iznad 10 mg / l, treba predložiti adenokarcinom ili rak pluća velikih stanica.

Konačno, iako je serumska koncentracija CYFRA 21-1, TPA, HCE, CEA često prisutna, nije uočena

jaka veza između proizvodnje tumorskih markera i histološke varijante tumora pluća. U većini slučajeva, visoka razina u ovom slučaju ukazuje na prevalenciju tumorskog procesa, pa bi stoga prognoza trebala biti razočaravajuća. Međutim, niske i prosječne vrijednosti tih markera nikada ne dopuštaju potpuno uklanjanje bilo koje varijante tumora ili napredovanja bolesti.

Unatoč svim gore navedenim ograničenjima, tumorski markeri u primarnoj dijagnostici raka pluća mogu biti važni u sljedećim situacijama.

Prvo, antigeni povezani s tumorom, izraženi tijekom početne dijagnoze, trebaju se koristiti u praćenju bolesnika. CYFRA 21-1, REA i CA 125 su vrlo značajni prognostički čimbenici u NSCLC i HCE u MRL.

Drugo, smanjenje razine tumorskih biljega u postoperativnom razdoblju (

2-3 dana za CEA, 1 dan za NSE, nekoliko sati

za CYFRA 21-1) daje liječniku korisne informacije o radikalnoj prirodi izvedene operacije i učinkovitosti terapije, a time io dobroj prognozi. S druge strane, sporo smanjenje razine markera u krvnom serumu ukazuje na nelogičnost provedene operacije i ukazuje na prisutnost rezidualnih tumorskih žarišta.

Treće, postupno povećanje tumorskog markera može biti prvi znak povratka bolesti. Takvo povećanje može se otkriti 12 mjeseci prije kliničkih znakova recidiva. Za rak pluća, HCE može poslužiti kao kriterij za diferencijalnu dijagnozu različitih histoloških tipova tumora, osobito u slučajevima kada nije moguće izvršiti biopsiju i potvrditi tip tumora s morfološkim podacima.

4.5. MOLEKULARNA GENETIČKA DIJAGNOSTIKA

Glavni zadatak moderne molekularne genetske dijagnostike (MHD, DNA dijagnostika) je otkrivanje nasljednih anomalija za kasniju uporabu u dijagnostici, izrada prognoze i odabir strategije liječenja mnogih bolesti. U isto vrijeme, MHD se smatra mnogo širem od jednostavnog analiziranja sekvence humane genomske DNA, budući da se gotovo uvijek dodatne informacije o nasljednoj bolesti mogu dobiti analizom stanja samih kromosoma i RNA, te proteina i metabolita.

Kao i druge metode kliničke biokemije, genetsko testiranje se koristi za diferencijalnu dijagnozu bolesti. U brojnim bolestima, primjerice u nasljednim oblicima raka ili "greškama metabolizma", otkrivanje mutacija postaje dijagnostički kriterij jednako važan kao i klinički simptomi. Međutim, glavna prednost DNK dijagnostike je sposobnost određivanja osjetljivosti na određenu bolest u presimptomatskoj fazi. U nekim slučajevima to omogućuje sprečavanje razvoja same bolesti kirurškim intervencijama, terapijom lijekovima ili promjenom načina života pacijenta. Osim toga, prenatalno DNK testiranje može otkriti nasljeđivanje patoloških gena i, sukladno tome, odrediti indikacije za umjetno prekidanje trudnoće.

Potrebno je uočiti takav obećavajući smjer MHD-a kao farmakogenetiku. Precizno tipiziranje pacijentovog genotipa omogućuje procjenu gena koji su izravno povezani s apsorpcijom, metabolizmom i djelovanjem lijeka, tj. Postoji realna mogućnost identificiranja pacijenata koji su posebno osjetljivi na određeni lijek i izbjegavanje komplikacija zbog netolerancije na ovaj lijek tijekom liječenja. U nekim slučajevima genotipizacija vam također omogućuje odabir najprikladnijeg lijeka. Već se može sa sigurnošću reći da se s razvojem farmakogenetike terapija lijekovima sve više oslanja na analizu pacijentovog genotipa.

Stoga, uporaba MHD u kliničkoj praksi nudi široke mogućnosti ne samo za dijagnosticiranje i procjenu genetskog rizika od bolesti, već i za odabir individualne terapije lijekovima. Nadamo se da će aktivni razvoj molekularne genetike čovjeka staviti DNK dijagnostiku usporedno s takvim neophodnim alatima u arsenalu liječnika biokemičara, kao što su, na primjer, metode za određivanje aktivnosti enzima u krvi.

4.5.1. VRSTE GENETIČKOG REBILIRANJA

U populaciji je obično nekoliko varijanti (alela) svakog gena. Ako je učestalost takvih varijanti prilično visoka i ne može se objasniti slučajnom pojavom identičnih mutacija u različitim obiteljima, onda govorimo o polimorfizmu tog lokusa.

Rijetke varijante gena nazivaju se mutacijama. Koja je granica između polimorfizma i mutacija? Smatra se da polimorfizam uključuje varijante gena pronađenih u heterozigotnom obliku više, a mutacije manje od 1% populacije. Međutim, u praksi se mutanti često nazivaju aleli koji predisponiraju određenu patologiju, čak i ako je njihova učestalost u populaciji iznad 1%. U nastavku su navedene vrste mutacija koje mogu dovesti do patoloških promjena.

• Missance mutacije, ili supstitucija nukleotida, je najčešći tip mutacije. Supstitucija nukleotida u nekim pozicijama kodona ne dovodi do zamjene kodirane aminokiseline; takve se mutacije nazivaju tihim ili sinonimnim. Kada se kodirana aminokiselina promijeni kao posljedica mutantne mutacije, funkcija proteina se često mijenja. Očuvanje funkcije proteina je uočeno ako

aminokiselina izvedena iz mutantnog kodona pripada istoj strukturnoj klasi kao i normalna aminokiselina. Supstitucije s jednom nukleotidom imaju najveći učinak na protein, što rezultira stvaranjem zaustavnog kodona (besmislene mutacije). Skraćena mRNA i proteini su često neaktivni i brzo se razgrađuju.

• Brisanje i umetanje. Takve mutacije variraju u dužini od jednog do milijuna nukleotida i, prema tome, nazivaju se mikro i makro-delecije (umetanja). Razumljivo, makromutacije utječu na vrlo velike segmente kromosoma (od 10 milijuna parova baza), tj. moguće ih je detektirati citogenetičkom analizom. Mikromutacije utječu na malu količinu nukleotida i koriste se metode za analizu nukleotidne sekvence DNA. Male insercije i delecije ne mogu utjecati na funkciju kodiranog proteina. Fatalne posljedice obično se uočavaju kada broj nukleotida za umetanje / brisanje nije višestruki od tri. Kada se to dogodi, sintetizira se pomak okvira čitanja i beznačajna aminokiselinska sekvenca. Najčešće se vrlo brzo prekida stvaranjem novog stop kodona. Klasičan primjer učinka pomaka okvira na učinke brisanja su dvije srodne bolesti - Duchenne i Becker mišićna distrofija. Oba su uzrokovana mutacijama u genu za distrofin, a 2/3 tih mutacija su u oba dijela bolesti. Beckerova mišićna distrofija je mnogo blaža od Duchenne, ali ta razlika nije povezana s veličinom brisanja. Razlog za razlike je u tome što u većini otkrivenih slučajeva Duchenneove miodistrofije, brisanja dovode do pomaka u okviru čitanja, i kao rezultat toga, distrofin prestaje da se potpuno formira, dok kod Becker-ove miodistrofije mutantni distrofin zadržava neku aktivnost.

• U nekim slučajevima mutacije utječu na nekodirajuća područja DNA koja su uključena u inicijaciju transkripcije danog gena ili spajanje mRNA. Takve promjene mogu također dovesti do narušavanja strukture, stabilnosti ili normalne regulacije ekspresije ovog proteina.

• Nestabilne, ili dinamične, mutacije se obično razvijaju u područjima koja sadrže višestruke kopije ponavljanja trinukleotida. Kao rezultat pogrešaka replikacije DNA ili nejednakog prelaženja, broj takvih ponavljanja može se povećati ili smanjiti, zbog čega se takve mutacije nazivaju dinamičkim. Ako je broj

ponavljanja premašuju određenu vrijednost praga, poremećena je funkcija danog ili obližnjih gena. Mehanizmi za isključivanje gena tijekom nakupljanja trinukleotidnih ponavljanja nisu u potpunosti jasni. Konkretno, kod sindroma krhkog X kromosoma, povećanje broja CGG ponavljanja u FRAXA lokusu iznad 200 dovodi do metilacije i inaktivacije ovog gena. Povećanje broja ponavljanja trinukleotida također je temelj Huntingtonove bolesti (više od 35 CAG ponavljanja u Huntingtonovom genu) i miotonične distrofije (preko 50 ponavljanja u 3'-netranslatiranoj regiji DMPK gena koji kodira proteinsku kinazu). Karakteristična značajka ovih bolesti je da se u jednoj obitelji ozbiljnost bolesti može povećati u nekoliko generacija zbog ekspanzije ponavljanja nukleotida.

Općenito, pojava mutacija dovodi do promjene funkcije ili ekspresije proteina. Ta se promjena očituje kao povećanje i smanjenje, često do potpunog gubitka, funkcije ili ekspresije proteina. U slučaju funkcionalnog povećanja, također je moguće da protein dobije nove funkcije.

POKRETI SA FUNKCIJAMA GUBITKA

Smanjenje funkcionalne aktivnosti proteina u tkivu može biti rezultat promjene strukture proteina i transkripcijske aktivnosti danog gena. Na primjer, smanjenje razine ekspresije LDL receptora zbog mutacije u promotorskoj regiji će dovesti do potpuno iste hiperholesterolemije koja bi se promatrala ako bi se sintetizirale normalne količine funkcionalno neispravnog receptora koje se ne mogu vezati ili internalizirati lipoproteine.

Promjene u strukturi proteina uzrokovane supstitucijama aminokiselina ili prekidom obrade mRNA kao rezultat mutacija na mjestima za spajanje dovode do pojave abnormalne mRNA i proteina koji su podložni ubrzanoj degradaciji, što rezultira smanjenjem ukupne količine aktivnog proteina. Na primjer, tri najčešće defektne alele gena s tiopurin metil transferazom kodiraju brzo razgradive proteine, što rezultira naglim smanjenjem enzimske aktivnosti, što je praćeno povećanom osjetljivošću pacijenata na tiopurine. U drugim slučajevima, kao što je a-talasemija, može se primijetiti brisanje cijelog gena, što dovodi do potpunog izostanka proizvoda.

Mehanizmi gubitka stvarne funkcionalne aktivnosti proteina mogu biti vrlo raznoliki. Kao rezultat, mutacije mogu

zamjena aminokiselina koje imaju ključnu ulogu u strukturi ili katalitičkoj aktivnosti. Kao rezultat mutacija, normalna obrada ili prijenos proteina mogu biti poremećeni. Na primjer, najčešća mutacija koja uzrokuje cističnu fibrozu, delecija fenilalanina na položaju 506 gena CFTR, ne utječe na sintezu ili funkcionalnu aktivnost ovog proteina, ali ometa njegov unutarstanični transport, zbog čega nije ugrađena u plazmatsku membranu i stoga gubi sposobnost funkcioniranja. kao kanal klora.

U pravilu, mutacije s gubitkom funkcije dovode do bolesti s recesivnim načinom nasljeđivanja. To je zbog činjenice da je za potpuno funkcioniranje metaboličkog puta obično dovoljna količina aktivnog proteina, kojeg proizvodi jedan normalan alel. I većina tih bolesti.

Manje su uobičajeni slučajevi u kojima količina sintetiziranog proteina postaje nedovoljna. U ovom slučaju, bolest će se početi pojavljivati čak i ako postoji jedan mutantni alel, a nasljeđivanje postaje dominantno. Malo se zna o takvim bolestima, a jedna od njih je obiteljska hiperkolesterolemija uzrokovana defektom gena LDL receptora. Ovu bolest karakterizira i učinak doze gena, što se očituje u činjenici da je obiteljska hiperkolesterolemija mnogo izraženija kod homozigota u usporedbi s heterozigotima.

Dominantni tip nasljeđivanja očituje se kada mutantni protein ne gubi samo svoju aktivnost, nego također ometa funkcioniranje normalnog alelnog produkta u heterozigotama. Ova situacija je uključena u literaturu nazvanu dominantno-negativni učinak. Ovaj efekt je nađen u slučaju multimernih proteina, koji posebno uključuju kolagene ili dimerne transkripcijske faktore.

MUTACIJE SA STJECANIM FUNKCIJAMA

Među širokim rasponom funkcije poboljšanja mutacije, najzanimljivija je sa stajališta kliničke biokemije slučajevi kada protein stječe novu funkciju. Novo stečena funkcija može se pojaviti na razinama kao što je interakcija enzima s novim supstratom, ireverzibilna aktivacija proteina koji prenosi signal ili ionski kanal, poremećaj normalnog procesa inaktivacije enzima, abnormalna oligomerizacija proteina ili sinteza himernog proteina.

Propustivost Ala je dobar primjer stjecanja funkcije.₃₆₆-Siva u GNAS1 genu koji kodira α-podjedinicu heterotrimernog GTP-vezujućeg proteina Gs. Ovaj protein povezuje 7-domene receptore transmembranskih hormona s adenilat ciklazom. Mutacija dovodi do dvostruke promjene u svojstvima proteina. Prvo, ubrzava se oslobađanje BDP-a i, prema tome, povećava se udio GTP-vezanog (aktivnog) ασ proteina, što dovodi do konstitutivne aktivacije adenilat ciklaze. Drugo, protein postaje termolabilan na 37 ° C. U tom smislu, u svim organima, osim testisa, smanjuje se aktivnost Gs, što dovodi do razvoja nasljedne osteodistrofije Albright. A u testisu, gdje je temperatura niža, Gs protein se nepovratno aktivira, što dovodi do testoksikoze.

Najčešći razlog za stjecanje funkcije je povećana ekspresija gena ili kršenje mjesta ili vremena njegove ekspresije, što je najkarakterističnije za maligno transformirane stanice.

Za mutacije sa stjecanjem funkcije, u pravilu je karakterističan dominantni tip nasljeđivanja. U rijetkim slučajevima u kojima su mutacije s usvajanjem funkcije u homozigotnom stanju, uočavaju se vrlo teški oblici bolesti, često s prenatalnom smrtnošću. Primjer je homozigotna ahondroplazija, najčešći uzrok patuljastosti, koja je uzrokovana mutacijama u FGFR3 genu, koji kodira receptor za faktor rasta fibroblasta. Brisanje mjesta kromosoma na kojem se FGFR3 nalazi u drugim bolestima ne dovodi do skeletnih abnormalnosti karakterističnih za achondroplasia, što upućuje na pojačanje ili stjecanje funkcije u ovoj bolesti. Achondroplasia se uvijek nalazi u heterozigotnom obliku, jer je homozigotnost za ovu osobinu smrtonosna.

NAČELA TRAŽENJA MUTACIJA

Opći pristup traženju mutacija u ljudskoj genomskoj DNA temelji se na brojnim načelima.

Uporaba jedne ili druge metode u DNK dijagnostici ovisi o dostupnosti informacija o mogućoj vrsti mutacije u danom pacijentu. U slučajevima kada je tip mutacije nepoznat, metode otkrivanja se koriste za otkrivanje bilo kakvih razlika u nukleotidnoj sekvenci mutiranih i normalnih gena. Ako je mutacija poznata, na primjer, već je identificirana kod srodnika, za pregled se koriste druga, jednostavnija.

i istodobno učinkovitije metode koje se mogu nazvati metodama detekcije poznatih mutacija.

Nadalje, bez obzira na usmjerenost (skrining ili detekcija) odabrane metode, potrebno je uzeti u obzir da se jedna skupina metoda temelji na specifičnosti sparivanja nukleotida u formiranju dvostrukog lanca DNA, a druga na prepoznavanju DNA slijeda pomoću enzima.

Za prvu skupinu postupaka, fragmenti sekvence gena koji se istražuju, koji odgovaraju divljem tipu, tj. Najčešćem u populaciji, koriste se kao referentna sekvenca. To može biti kratki oligonukleotidni prajmer (oko 20 nukleotida) ili dulji fragment DNA korišten za hibridizaciju. U slučaju da pacijentova DNA sadrži mutaciju u području pokrivenom uzorkom, nemoguća je puna hibridizacija između mutiranog alela i uzorka. To dovodi ili do odsustva produkta lančane reakcije polimeraze (PCR), ili do stvaranja neadekvatnog dupleksa DNA koji sadrži neparene nukleotidne regije, koje se detektiraju različitim kemijskim ili enzimatskim metodama.

Klasičan primjer metode koja se temelji na prepoznavanju DNA sekvencija enzima je uporaba restrikcijskih enzima, enzima koji cijepaju DNA u područjima koja sadrže striktno pojedinačne sekvence od 4-8 nukleotida u dužini. Pojava odstupanja u nukleotidnoj sekvenci kao rezultat mutacije može dovesti ili do gubitka već postojećeg mjesta cijepanja za bilo koji restrikcijski enzim, ili, obrnuto, do njegovog izgleda. U istoj skupini metoda koriste se enzimi DNA polimeraze. Ovi enzimi sintetiziraju komplementarni lanac u točnom skladu sa sekvencom jednolančane matrice. Koristeći obilježene nukleotidne blokove, moguće je odrediti u kojoj se sekvenci nukleotidi nalaze u danoj matrici. Ovaj princip je u osnovi enzimatskog sekvenciranja (određivanje nukleotidne sekvence) prema Sanger-ovoj metodi, kao iu njenim pojednostavljenim varijantama, dizajniranim za određivanje nukleotidne sekvence kratkih DNA segmenta (mini-sekvenciranje).

U velikoj većini slučajeva, prije analize vlastitih mutacija, istraženi fragment genoma pacijenta je pojačan PCR-om. Cilj PCR-a je obično jednostavno umnožavanje.

broj kopija ovog fragmenta, što olakšava tehnički naknadnu analizu DNA (slika 4.3). U većini PCR varijanti u heterozigotima, normalni i mutirani aleli su pojačani istom učinkovitošću, a njihova se diskriminacija provodi u narednim fazama. Tu je i alel-specifičan

Sl. 4.3. Shema lančane reakcije polimeraze

PCR, u kojem se primjenjuju prajmeri koji su homologni normalnom ili mutantnom alelu, što omogućuje prisutnost mutacije koja se već određuje u fazi PCR prisutnošću ili odsutnošću produkta amplifikacije.

Još jedna univerzalna metoda koja se obično koristi za dijagnosticiranje mutacija je sekvenciranje DNA. Sekvenciranje se koristi i za traženje nepoznatih mutacija i za potvrđivanje kršenja otkrivenih drugim metodama. Postojeće metode omogućuju izravno sekvencioniranje PCR produkata, zaobilazeći kloniranje PCR fragmenta u bakterijama. Prednost sekvenciranja je svestrana i vrlo informativna. Glavno ograničenje ove metode je visoka cijena, koja ne dopušta da se ona koristi kao glavna pri traženju mutacija.

Broj postojećih metoda za analizu mutacija je iznimno velik, a za njihov opis bez pretjerivanja potrebna je posebna knjiga. Ispod su opisi samo onih metoda koje su bolje prilagođene za uporabu u kliničkoj praksi, tj. udovoljavaju sljedećim zahtjevima: dovoljna osjetljivost za identificiranje mutacija, dobra reproducibilnost, niska cijena i mogućnost automatizacije.

METODE MUTACIJSKOG PROVJERA

Metode mutacijskog skrininga koriste se u slučajevima kada je priroda mutacije nepoznata, a klinička slika nasljedne bolesti sugerira u kojim se genima može dogoditi pregrađivanje. Na primjer, prisutnost tipa hiperkolesterolemije IIa u kombinaciji s ksantomima tetiva ukazuje na prisutnost obiteljske hiperkolesterolemije i sugerira da se mutacija treba tražiti u genima povezanim s hvatanjem LDL stanica, prvenstveno u genu LDL receptora. Budući da su mutacije u ovom genu s obiteljskom hiperkolesterolemijom vrlo raznolike i mogu utjecati na cijelu dužinu gena, potrebno je analizirati velike dijelove DNA. Sekvenciranje tako velikog fragmenta gena je preskupo, stoga se koriste jednostavniji postupci.

ANALIZA MAKRO-OBNOVLJIVOG DNK BLOTTANJA

Za traženje makroskopske DNA koristeći Southern blotting. U ovoj metodi, genomska DNA je inicijalno fragmentirana pomoću restrikcijskog enzima, nakon čega je nastala

DNA fragmenti su odvojeni gel elektroforezom, denaturirani i preneseni u nitroceluloznu membranu. DNA na otisku dobivenom iz gela (blot) inkubira se s obilježenim fragmentom gena koji se ispituje, koji hibridizira s onim genomskim fragmentima DNA koji sadrže gen. U prisutnosti makroskopske DNA koja utječe na taj gen, skup ili veličina fragmenata s kojima se obilježeni uzorak hibridizira razlikovat će se od norme.

Sl. 4.4. Heteroduplex analiza

HETERODUPLEXNA ANALIZA Teže je tražiti mikrodelecije / insercije veličine manje od 25 parova baza, kao i jednostruke nukleotidne supstitucije. Za njihovu analizu često se koriste posebne varijante elektroforetskih metoda. Jedna od najjednostavnijih je heteroduplex analiza (slika 4.4). U ovoj metodi, uzorak koji sadrži mješavinu normalnog (referentnog) i umnoženog fragmenta DNA pod istragom se zagrijava da se denaturira DNA, a zatim ohladi vraćanjem strukture dvolančane DNA. Budući da prisutnost malih razlika u sekvenci nukleotida ne sprječava hibridizaciju, dio rezultirajućih dupleksa sastoji se od referentne i testirane DNA. U područjima referentne i ispitne DNA, koja se razlikuju u sastavu nukleotida, normalno sparivanje nukleotida je nemoguće i nastaje takozvana neusklađenost. Dvolančana DNA, koja ima neusklađenost u svojoj strukturi, na elektroforezi migrira različito od potpuno komplementarnog dupleksa, koji omogućuje otkrivanje abnormalno migrirajućih fragmenata nakon bojanja DNA.

ANALIZA POLIMORFIZMA USKLAĐENOSTI JEDINKRANNE DNK

Još jedna popularna elektroforetska metoda mutacijskog skrininga je konformacijski polimorfizam jednolančanog konformacijskog polimorfizma (SSCP). Načelo metode temelji se na činjenici da se, ako se denaturirano zagrijavanje DNA oštro ohladi, ne stvaraju pretežno dvostruki duplexi, već kratki dvolančani dijelovi unutar svakog jednolančanog DNA fragmenta (slika 4.5). Obično se formira nekoliko relativno stabilnih varijanti, koje zbog različite prostorne konformacije migriraju na različite načine na elektroforezi. Područja komplementarnosti unutar lanca obično su kratka, a svaka promjena kao rezultat čak i jednostruke nukleotidne supstitucije obično dovodi do nestanka ovog oblika intraheinog dupleksa. Kao rezultat, raspodjela i intenzitet jednolančanih DNK traka mijenja se na elektroforegramu. Ova metoda ne govori ništa o prirodi razlika u nukleotidnoj sekvenci, tako da abnormalni uzorci moraju biti sekvencirani.

Sl. 4.5. Analiza polimorfizma konformacije jednolančane DNA

ELEKTROFOREZA DNK ARHITEKTURE AT DENATURANTNA GRADIENTA Električnije elektroforetska analiza u denaturantskom gradijentu elektroenergetski analizirana u elektroenergetici denaturanta (slika 4.6). Očigledno, bilo koja nukleotidna supstitucija će dovesti do promjene u jakosti DNK dupleksa, te će denaturirati u jednostruke lance na abnormalnoj temperaturi ili koncentraciji denaturirajućeg agensa u usporedbi s normalnim slijedom. U ovoj metodi elektroforeza se provodi u poliakrilamidnim gelovima koji sadrže višu koncentraciju denaturanta u donjem dijelu nego u gornjem dijelu. Tijekom elektroforeze, normalni i mutirani fragmenti DNA su denaturirani u različitim dijelovima gela. Budući da je pokretljivost nastalih pojedinačnih lanaca mnogo niža,

Sl. 4.6. Elektroforeza u gradijentu denaturanta

nego dvolančana DNA (zbog konformacijskih karakteristika jednolančane DNA), denaturirani fragment oštro usporava migraciju, dok se dvolančani i dalje kreću. Kao rezultat, normalni i mutantni fragmenti DNA migriraju na različitim udaljenostima u gelu. Ponekad kao denaturant koristi ne kemijsku tvar, već temperaturni gradijent.

DENATURING EFIKASNA TEKUĆINA GORIVA

KROMATOGRAFIJA Razlike u jakosti normalnog i mutantnog dupleksa također se mogu detektirati uporabom tekućinske kromatografije visoke djelotvornosti. U ovoj metodi, fragment DNA, slično gore opisanim elektroforetskim metodama, izložen je gradijentu denaturirajućih agenasa, ali se DNA analiza provodi kromatografskom metodom koristeći spektrofotometrijsku detekciju. Ova metoda je vrlo osjetljiva i lako se automatizira, te se stoga sve više koristi za kliničku DNK dijagnostiku.

KEMIJSKA DETEKCIJA NEUPAKIRANOG NUKLEOTIDA Druga skupina metoda temelji se na otkrivanju mutacija korištenjem enzima ili kemijske obrade koja specifično uništava područja ne-komplementarnog parenja.

Analizirani fragment DNA je denaturiran, pomiješan s kontrolnim uzorkom koji sadrži normalnu DNA, i ohlađen da formira dupleks, od kojih će neki, ako pacijent ima mutacije, sadržavati područja nesparenih baza. Tretiranje DNA heterodupleksa s hidroksilaminom ili osmijevim tetroksidom dovodi do modifikacije nesparenih nukleotida koji sadrže citozin i timidin. Naknadna obrada s piperidinom dovodi do cijepanja DNA na nukleotidu. Kao rezultat, veličina DNK je očuvana u normalnim uzorcima, a mutantni sadrže skup fragmenata koji odgovaraju mutacijama koje utječu na nukleotide C ili T. Ova metoda nije široko korištena, vjerojatno zbog visoke toksičnosti korištenih reagensa.

ZAŠTITA OD RNKAZY U drugoj metodi, prisutnost nesparenih nukleotida određuje se pomoću enzima RNaze. Ova metoda koristi obilježenu RNA sondu koja odgovara normalnoj sekvenci gena, koja hibridizira s DNA fragmentom koji se istražuje (Sl. 4.7). Kao dio dupleksa DNA / RNA, RNA je otporna na RNazu, stoga se ova metoda zove zaštita od RNaze. Međutim, u područjima različitima u nukleotidnom slijedu između uzorka i uzorka koji se analizira, ne dolazi do sparivanja nukleotida. Formiranje RNA fragmenata je zabilježeno elektroforezom. Ova metoda je jedna od najosjetljivijih i specifičnih mutacija, ali nije široko korištena, očigledno zbog neugodnosti rada s labilnim RNA sondama. Postoje i druge metode koje se temelje na enzimskom prepoznavanju nesparenih baza; nije jasno koliko će se oni široko koristiti u kliničkoj dijagnozi.

PREGLED DIJAGNOSTIČKIH MUTACIJA Elektroforetske metode mutacijskog probira su ne-apsolutna osjetljivost, obično detektiraju samo oko polovice mutacija i polimorfizama u analiziranim fragmentima, a samo osjetljivost denaturiranja

elektroforeza se približava 100%. U kombinaciji s relativno niskom cijenom i mogućnošću automatizacije, ova metoda postaje sve popularnija.

Još jedna značajka metoda probira je da, uz pozitivne rezultate, potrebna je dodatna sekvenciranja ili analiza restrikcijskih enzima jer metode skrininga nisu

Sl. 4.7. Metoda zaštite RNase

dati bilo kakve informacije o prirodi nukleotidnih razlika. Kada se provodi DNK dijagnostika, nije dovoljno detektirati odstupanje u nukleotidnoj sekvenci kod pacijenta, što dovodi do zamjene kodirane aminokiseline. Potrebno je potvrditi da je ta supstitucija amino kiseline funkcionalno značajna. Izravna metoda se sastoji u dobivanju rekombinantnog mutantnog proteina i određivanju njegove aktivnosti. Ovaj dugotrajan i skup pristup uglavnom se koristi u istraživačke svrhe. U praksi se češće rukovode vrstom aminokiselinske supstitucije. U slučaju kada normalne i mutantne aminokiseline pripadaju različitim strukturnim klasama, vjerojatnost funkcionalnih promjena u proteinu je veća. Vjerojatnost disfunkcije proteina je još veća ako mutacija utječe na evolucijski očuvane dijelove gena, tj. One odredbe u kojima je ista aminokiselina prisutna u nekoliko vrsta sisavaca. Prisutnost takvih mjesta obično utječe na sintezu, transport ili funkcioniranje proteina, a svaka promjena u njima utječe na aktivnost proteina. Na primjer, analiza sekvence gena LDL receptora kineskog hrčka, zeca, štakora, miša i Xenopus laevis pokazala je 81, 79, 77, 76 i 70% homologiju humanog receptora. Baza podataka UMD-LDLR dostupna putem Interneta sadrži brojne programe za analizu mutacija u genu LDL receptora, uključujući i mogućnost analize konzervativnosti svakog segmenta gena.

Dodatne informacije o patogenosti mutacije mogu se dobiti ispitivanjem rođaka pacijenta. U slučaju da je ista mutacija prisutna kod rođaka bolesnika s znakovima ove bolesti (na primjer, povišena razina kolesterola u obiteljskoj hiperkolesterolemiji), ali je odsutna kod zdravih osoba (više od 100 donora se obično pregledava bez znakova ove bolesti), vjerojatnost da Ova mutacija je patogena, vrlo visoka.

Općenito, unatoč ne-apsolutnoj osjetljivosti metoda skrininga mutacija, omjer između sadržaja informacija i troška tih metoda je prilično visok i široko se koriste u praksi. Međutim, treba imati na umu da je njihova negativna prediktivna moć mala. Drugim riječima, nepostojanje bilo kakvih svojstava uzorka DNA kada se analizira metodama probiranja ne znači da ta DNA ne sadrži mutacije.

METODE DETEKCIJE MUTACIJE

U slučaju kada su poznate moguće varijante genetskih preraspodjela i nema ih mnogo, mogu se koristiti metode koje su brže i jeftinije od metoda mutacijskog skrininga. Ove metode se temelje ili na DNA hibridizaciji, ili na sposobnosti restrikcijskih enzima da prepoznaju dobro definirane nukleotidne sekvence ili DNA polimeraze da sintetiziraju DNA koja je komplementarna matrici (mini-sekvenciranje).

Sl. 4.8. Analiza ograničenja

ANALIZA OGRANIČENJA Najjednostavnija metoda za otkrivanje mutacija je restrikcijska analiza (slika 4.8). Osnova ove metode je vrlo visoka specifičnost restrikcijskih endonukleaza u odnosu na određene nukleotidne sekvence. Svaki od ovih bakterijskih enzima prepoznaje strogo individualni slijed od 4-8 nukleotida i siječe dvostruki lanac DNA unutar ili blizu ovog mjesta. Dovoljno je zamijeniti jedan nukleotid da bi se prekršilo ograničenje ovog enzima. U onim slučajevima kada je polimorfni nukleotid dio restrikcijskog mjesta, može se genotipizirati sa 100% pouzdanošću pomoću restrikcijskog enzima. Nukleotidne supstitucije najčešće krše postojeća restrikcijska mjesta, ali ponekad stvaraju nova mjesta. Nedostatak metode je u tome što polimorfni nukleotidi ne leže uvijek u mjestima prepoznavanja bilo kojeg restrikasa. Djelomično rješenje je moguće u slučajevima gdje područje u kojem se nalazi mutacija sadrži barem neke od nukleotida koji čine mjesto restrikcije. Kompletno mjesto restrikcije može se stvoriti umjetno tijekom PCR. Da bi se to postiglo, upotrijebimo prajmere koji ne odgovaraju u potpunosti sekvenci nukleotida u području mutacije, ali sadrže 1-2 ne-komplementarna nukleotida koji komplementiraju restrikcijsko mjesto, što će uključivati polimorfni nukleotid. Obično, uvođenje malog broja ne-komplementarnih baza neznatno smanjuje učinkovitost PCR, dakle, nakon amplifikacije, pojavljuje se novo restrikcijsko mjesto u produktu, u kojem je također uključen polimorfni nukleotid. Daljnja restrikcijska analiza provodi se na isti način kao u standardnoj metodi.

ALLELSPECIFIC PCR U nekim slučajevima, PCR se može koristiti da ne obogati istraživani fragment genomske DNA, nego da izravno detektira mutaciju (Slika 4.9). U ovoj izvedbi, jedan od primera hibridizira s DNA područjem unutar kojeg se nalazi polimorfni nukleotid. Temperatura žarenja početnica je odabrana tako da se vezanje prajmera i naknadno pojačanje odvijaju samo uz potpunu podudarnost DNA i sekvenci primera. Na primjer, kada se prajmer koji odgovara mutantnoj sekvenci veže za normalnu DNA, formira se nespareni nukleotid, koji smanjuje jačinu vezanja praha na DNA. Na dovoljno visokoj temperaturi žarenja

Sl. 4.9. Alel-specifična lančana reakcija polimeraze

općenito prestaje vezati na normalan alel, PCR se ne nastavlja i proizvod se ne akumulira. Obično se paralelno dovodi reakcija s prajmerom koji odgovara normalnom alelu. Ova reakcija služi kao pozitivna kontrola, pokazujući normalan tijek amplifikacije. Budući da prisutnost jedne neusklađenosti može neznatno smanjiti jačinu vezanja prajmera na DNA, ponekad se u početnu sekvencu uvodi druga neusklađenost kako bi se dodatno destabilizirala dupleks i smanjio prinos produkta u prisutnosti nesparenog nukleotida u polimorfnoj regiji.

PCR R REAL REMAINS

Prednost gore opisanog alel-specifičnog PCR postupka je smanjenje broja faza u postupku analize, budući da ne zahtijeva obradu proizvoda s restrikcijama ili korištenje složenih elektroforetskih metoda.

Štoviše, metoda se ubrzava korištenjem PCR-a u stvarnom vremenu (RT-PCR). U ovoj metodi, formiranje produkta nije praćeno elektroforezom, kao u standardnoj PCR metodi, već izravno tijekom PCR za akumulaciju dvolančane DNA u reakcijskom mediju. Akumulacija DNA određena je nakon svakog ciklusa polimerizacije povećanjem fluorescencije SYBR Green boje ili njenih analoga, čija se fluorescencija dramatično povećava u interakciji s dvolančanom DNA, ali ne ovisi o prisutnosti nukleotida ili prajmera. Instrumenti za RT-PCR su kombinacija PCR pojačala i fluorimetra. Po završetku amplifikacije, specifičnost dobivenog proizvoda može se odrediti mjerenjem točke taljenja, koje se prati kako bi se smanjila fluorescencija SYBR Green.

TESTIRANJE TESTIRANJA Postoje i drugi načini za registriranje PCR proizvoda izravno u reakcijskoj smjesi bez elektroforeze. Metoda, patentirana od strane Hofmann LaRoche, temelji se na detekciji amplificirane DNA pomoću oligonukleotidne sonde koja hibridizira sa središnjim dijelom amplificirane sekvence. Na krajevima uzoraka oligonukleotida, nazvanih TaqMan, su nukleotidi obilježeni s dva različita fluorescentna bojila, od kojih jedna gasi fluorescenciju drugog. Kao rezultat gašenja, razina fluorescencije druge boje je mala. Taq polimeraza, koja dovršava novi lanac iz jednog od primera, razdvaja uzorak TaqMan, koji se veže na sredinu područja amplificirane DNA, zbog njegove aktivnosti eksonukleaze, što rezultira oslobađanjem fluorescentno obilježenih nukleotida u otopinu, a učinak gašenja nestaje jer se samo promatra kada su fluorofori smješteni blizu jedan drugome. Kao rezultat toga, fluorescencija boje se povećava više, više oligonukleotidnih uzoraka je uništeno DNA polimerazom tijekom amplifikacije, tj. što se više stvara. Ova metoda se također koristi za analizu mutacija. U tu svrhu koriste se dva TaqMan uzorka, označena različitim parovima fluorofora i razlikuju se u nukleotidnoj sekvenci u polimorfnom području, od kojih jedna odgovara divljem tipu, a druga mutantnom. Degradacija uzorka polimeraze DNA

Sl. 4.10. TaqMan sonde. P - reporterska boja, T - gasitelj fluorescencija

se provodi na temperaturi na kojoj se pohranjuju samo potpuno komplementarni kompleksi između analiziranog fragmenta i uzoraka. Povećanjem fluorescencije boja koje čine normalan ili mutirani uzorak moguće je odrediti koje su varijante prisutne u uzorku koji se analizira. Ova metoda omogućuje pouzdanu razliku između hetero-i homozigotnih nositelja mutacija.

Molekularne peći Druga metoda detekcije mutacija, utemeljena na učinku gašenja fluorescencije, primjenjuje se u metodi molekularnih signala (slika 4.11). Oligonukleotid se naziva plutačom, čiji su 3'- i 5'-krajevi obilježeni s dvije boje, od kojih jedna djeluje kao gasitelj. Za razliku od TaqMan uzoraka, plutače su duže i sadrže krajeve kraćih komplementarnih dijelova, koji su se pri običnoj temperaturi međusobno žarili i oblikovali ukosnicu. U ovom slučaju, boje koje se nalaze na krajevima oligonukleotida se približavaju jedna drugoj i fluorescencija jedne boje se gasi s drugom. Na sredini plutače nukleotidna sekvenca odgovara istraživanom području DNA. Nakon denaturacije zagrijavanjem, što dovodi do taljenja ukosnice, smjesa DNA s plutačama se hladi, što omogućuje formiranje dupleksa plutače s analiziranom DNA. Nakon daljnjeg hlađenja, klinovi se ponovno formiraju u slobodnim plutačama, a fluorescencija se smanjuje. Nasuprot tome, u svjetionicima vezanim za analiziranu DNA,

Sl. 4.11. Metoda molekularnih dolara. P - reporterska boja, T - gasitelj fluorescencija

boje ostaju udaljene jedna od druge i njihova fluorescencija ostaje visoka. Hibridizacija ispitivane DNA s posudama koje sadrže normalnu ili mutantnu nukleotidnu sekvencu u središnjem dijelu omogućuje određivanje genotipa testne DNA.

HIBRIDIZACIJA S SVIM POSEBNIM

Ova metoda se temelji na hibridizaciji test DNA s oligonukleotidima homolognim mjestu mutacije i okolnom sekvencom. Ova metoda postoji u dva oblika. Ponekad se PCR produkt imobilizira na čvrstoj osnovi i u otopinu se dodaju obilježeni oligonukleotidi. Uvjeti pranja su odabrani na takav način da se unište dupleksi koji sadrže nesparene baze. Kao rezultat, samo oligonukleotidi koji su 100% komplementarni analiziranoj DNA ostaju na matrici. Dodavanjem oligonukleotida koji odgovaraju sekvenci normalnoj ili mutantnoj varijanti, moguće je odrediti koji je nukleotid prisutan u analiziranoj DNA. U drugoj varijanti ove metode, oligonukleotidi su imobilizirani na matrici, s kojom se obilježeni PCR proizvod hibridizira.

Prednost metode hibridizacije s oligonukleotidima je mogućnost njezine minijaturizacije, kada se širok skup oligonukleotida imobilizira na mikročipu, što vam omogućuje da istovremeno detektirate mnoge mutacije. Glavna poteškoća ove metode je potreba za strogim odabirom uvjeta za hibridizaciju i ispiranje nepotpuno komplementarne DNA. Nije jasno koliko će široko ova metoda biti korištena u praktičnoj DNK dijagnostici.

REAKCIJA SVIH SPECIFIČNIH LIGAZA Djelotvorna metoda za detektiranje jednostrukih nukleotidnih supstitucija i kratkih preraspodjela je ligazna reakcija (slika 4.12). Analizirana DNA hibridizira se s dva oligonukleotida, od kojih jedan završava s nukleotidom, komplementaran s polimorfnim mjestom, a drugi izravno s njim. Nakon završetka hibridizacije, enzimska DNA ligaza unakrsno povezuje oligonukleotide da bi formirala duži fragment, koji se uvelike razlikuje od originalnih oligonukleotida u pokretljivosti.

Sl. 4.12. Alel specifična ligazna reakcija

s elektroforezom. Ako oligonukleotidi nisu potpuno komplementarni s fragmentom DNA i nakon hibridizacije nastaje nespareni nukleotid u polimorfnom području, ligaza ne povezuje takve oligonukleotide i ne nastaje dugi fragment. Tako, provodeći ligaznu reakciju s jednim zajedničkim i jednim od dva alel-specifična uzorka, može se genotipizirati uzorak DNA za dani nukleotid.

U ovoj metodi, PCR produkt je hibridiziran s vezanjem oligonukleotida na b'-strani mjesta polimorfizma (Slika 4.13). Nakon hibridizacije, reakcijskoj smjesi se doda DNA polimeraza i jedan od četiri modificirana nukleotida. U ovoj reakciji koriste se fluorescentno obilježeni dideo-nukleotidi, zbog čega DNA polimeraza može dovršiti samo jedan nukleotid komplementaran s onim koji se nalazi u analiziranom položaju. Prema tome, reakcija će se odvijati samo u epruveti, gdje je dodan nukleotid, komplementaran analiziranom. U nekim slučajevima, sva četiri nukleotida su prisutna u reakcijskoj smjesi, ali su označena različitim bojama. Analiza fluorescencije na četiri valne duljine omogućuje vam da odredite koji je nukleotid aktiviran i, shodno tome, analizirani nukleotid je komplementaran njemu. Budući da ova metoda koristi isti princip kao i kod enzimatskog sekvenciranja DNA, često se naziva mini-sekvenciranje.

Postoje i druge metode za određivanje mutacija na temelju aktivnosti DNA polimeraze. U jednom od njih, koji se naziva piroekstenzijom, svaki korak produženja lanca DNA polimeraze bilježi se formiranjem pirofosfata, koji se prati konjugiranim enzimskim reakcijama, što rezultira izbijanjem kemiluminescencije kao odgovor na stvaranje pirofosfata (slika 4.14). Ova metoda omogućuje sekvenciranje samo vrlo kratkih dijelova DNA, pa je njegova glavna svrha analizirati mutacije. Nukleotid koji se analizira identificira se dodavanjem kojega od četiri nukleotida (konvencionalni nukleotidi koji se koriste u ovoj metodi) rezultira izbijanjem kemiluminescencije.

Sl. 4.13. minisequencing

Sl. 4.14. Princip sekvenciranja DNA

DETEKCIJA MUTACIJE Β DIJAGNOSTIKA Kada se pravilno koriste, metode otkrivanja utvrđuju prisutnost ili odsutnost mutacija s vrlo visokom osjetljivošću i specifičnošću, što omogućuje da se informacije dobivene ovim metodama koriste za donošenje vrlo važnih odluka, kao što je potreba za pobačaj tijekom prenatalne dijagnostike.

Postoje dvije metode za prenatalnu dijagnostiku. Amniocenteza se sastoji u izboru oko 10 ml amnionske tekućine kroz trbušnu stijenku (Slika 4.15). Optimalni pojam

Sl. 4.15. amniocenteza

izvođenje - 16. tjedan trudnoće. Fetalne stanice se izoliraju iz tekućine centrifugiranjem i odmah se analiziraju PCR-om ili se stavljaju u kulturu. Stanice u kulturi dijele se i nakon nekog vremena su dovoljne za provođenje kromosomske analize, a kasnije - biokemijske. Druga metoda, biopsija korionskih vilusa, moguća je u ranijim stadijima trudnoće, u tjednu 10-12 (slika 4.16). Ovaj se postupak sastoji od transabdominalne ili transcervikalne biopsije korionskih resica. Chorionske stanice mogu se kultivirati ili analizirati odmah ako postoji dovoljno materijala za DNK analizu. Ako se otkriju kromosomske abnormalnosti ili mutacije, roditelji mogu prekinuti trudnoću.

Provođenje prenatalne dijagnoze mutacija ima smisla kada postoji pouzdana metoda za otkrivanje mutacije koja je prisutna u datoj obitelji. U nekim slučajevima može se odrediti

Sl. 4.16. Biopsija korionija

je li fetus naslijedio nasljednu bolest, ne znajući točno mjesto mutacije, već se oslanjajući na analizu genetske povezanosti bolesti u obitelji. Međutim, to nije uvijek moguće, jer za analizu povezanosti potrebni su uzorci DNA od nekoliko bolesnih srodnika i velik broj zdravih članova obitelji.

4.5.2. OBILJEŽJA DNK DIJAGNOSTIČKE PRIMJENE

Maksimalna dijagnostička vrijednost genetskog testiranja uočena je u slučajevima gdje postoji visoka korelacija između prisutnosti genetskog defekta i vjerojatnosti razvoja patologije, odnosno bolesti s visokom penetracijom.

Takve bolesti doživljavaju stalni pritisak prirodne selekcije, zbog čega je njihova učestalost u općoj populaciji obično mala. U tom smislu, većina primijenjenih genetskih testova povezana je s dijagnozom rijetkih oblika bolesti. Čak i najčešći oblici ljudskih monogenih bolesti, opisani u nastavku, se klinički manifestiraju ne češće nego u jednoj osobi od nekoliko stotina.

Uobičajene ljudske bolesti kao što su hipertenzija, dijabetes, kardiovaskularne bolesti, iako ovisne o genetskim čimbenicima, imaju nisku penetraciju, složenu, promjenjivu i slabo proučenu genetsku strukturu, dakle, unatoč očiglednoj potrebi traženja genetske predispozicije za obične bolesti, rezultati istraživanja u praksi su vrlo ograničena.

FAKTORI UČINKOVITOSTI Odnos informativnosti rezultata DNK dijagnostike i troškova njegove provedbe u velikoj je mjeri određen genetskom kompleksnošću bolesti. Primjeri uključuju hemokromatozu, u kojoj dvije mutacije uzrokuju gotovo sve kliničke slučajeve među bijelom populacijom, i obiteljsku hiperkolesterolemiju, koja može biti uzrokovana s više od 800 mutacija u genu LDL receptora, od kojih nijedna nije češća nego u 1% bolesnika s obiteljska hiperkolesterolemija. Većina nasljednih bolesti su intermedijarne u ovom rasponu, približavajući se obiteljskoj hiperkolesterolemiji, kada troškovi dijagnostike DNA mogu ograničiti njegovu provedbu.

Pod određenim uvjetima može se smanjiti složenost dijagnoze i, prema tome, njezin trošak. To je moguće u populacijama u kojima je genetska struktura bolesti jednostavnija nego u drugim populacijama. Taj je učinak najizraženiji kod populacija s tzv. Ovaj genetski izraz znači da je značajan dio populacije naslijedio određenu mutaciju od jednog od svojih predaka. Zbog ovog čisto slučajnog događaja u ovoj populaciji, većina slučajeva ove bolesti je uzrokovana ovom mutacijom. Tipičan primjer koji se odnosi na genetsko testiranje je populacija Afrikanera, ljudi južne Afrike sjevernog europskog podrijetla. Suvremeni afrikanci su potomci malog broja obitelji iz Nizozemske koje su migrirale u Afriku u 17.-18. Stoljeću. Među afrikanerima, obiteljska hiperkolesterolemija, koja dovodi do ranog razvoja koronarne arterijske bolesti, nekoliko je puta češća nego u europskoj ili američkoj populaciji. Osim toga, velika većina (> 95%) slučajeva obiteljske hiperkolesterolemije u bijeloj južnoafričkoj populaciji posljedica je prisutnosti jedne od samo tri mutacije u LDL receptoru. Takva genetska homogenost oštro je u suprotnosti s genetičkom strukturom obiteljske hiperkolesterolemije u drugim zemljama, gdje su opisane stotine mutacija, od kojih nijedna nije češća nego u 1-2% bolesnika. Čini se da je nekoliko imigrantskih obitelji (najmanje tri) imalo mutacije, koje se sada nazivaju afrikanerskimi, koje su postale glavni uzrok obiteljske hiperkolesterolemije kod njihovih potomaka. Sa stajališta praktične medicine, molekularno genetsko testiranje bijelih ljudi u Južnoj Africi na prisutnost obiteljske hiperkolesterolemije prilično je učinkovit i relativno jeftin pristup koji omogućuje presimptomatsku dijagnozu ove bolesti. Za razliku od Južne Afrike, druge zemlje zahtijevaju mnogo skuplji arsenal molekularnih metoda za postavljanje takve dijagnoze.

Za ostale nasljedne bolesti također postoji razlika u učestalosti mutacija među populacijama. Na primjer, misens mutacija cis₂₈₂

Guma u genu HFE, koja dovodi do razvoja hemokromatoze, vrlo je česta u europskim populacijama, gdje je učestalost njezinih nositelja do 10-15%. Nasuprot tome, u afričkim, azijskim i australskim starosjedilačkim populacijama

Ova mutacija je vrlo rijetka. Pretpostavlja se cis mutacija₂₈₂-Guma je nastala u Europi prije otprilike 2000 godina.

Osim učinka osnivača, drugi biološki mehanizam koji pojednostavljuje traženje mutacija čak iu genetski otvorenoj populaciji je prisutnost točaka vrućih mutacija u genima. Dokazano je da se vjerojatnost pojave mutacija razlikuje u područjima genoma s različitim sadržajem GC-nukleotida. Također je poznata sekvenca u kojoj je zaustavljena DNA polimeraza a; u takvim regijama, sporadične delecije se često nalaze u različitim genima. Zbog tih faktora mutacije nisu ravnomjerno raspoređene po duljini gena, već su koncentrirane u određenim područjima, što pojednostavljuje njihovo pretraživanje.

Stoga su za učinkovitu DNK dijagnostiku potrebne informacije o najčešćim mutacijama koje dovode do razvoja ove bolesti u populaciji kojoj pacijent pripada.

ČIMBENICI DIJAGNOSTIČKE VRIJEDNOSTI

U nizu nasljednih poremećaja metabolizma, može se posumnjati na prisutnost bolesti tijekom biokemijske analize. Primjerice, bolesnici s obiteljskom hiperkolesterolemijom obično imaju povišene razine LDL kolesterola, a kod hemohromatoze povećava se zasićenje transferina željezom. Biokemijski parametri podliježu varijabilnosti u svakom pojedincu. Kao rezultat, pojedinci, na primjer, s povišenim razinama LDL kolesterola, preporučaju se ponoviti testove u razmaku od 3 mjeseca kako bi se uvjerili da je otkriveno metaboličko odstupanje pouzdano. U nekim slučajevima, biokemijski pokazatelji su u tzv. Sivoj zoni, što dodatno komplicira dijagnozu. Ovdje DNK dijagnostika može pomoći. Prisutnost mutacije pokazuje prosječnu predispoziciju tijekom života da se taj biokemijski parametar prebaci na patološku stranu, da tako kažemo, patološku spremnost. Za razliku od biokemijskog fenotipa, genotip nije podložan individualnim i populacijskim varijacijama koje su karakteristične za biokemijske parametre. Dakle, DNK dijagnostika omogućuje da se potvrdi biokemijska dijagnoza neovisnom metodom, kao i da se isključi prisutnost drugih uzroka ovog biokemijskog poremećaja. Očito, maksimalna informativnost DNK dijagnoze nasljednih poremećaja metabolizma postiže se kada se kombinira s klasičnim biokemijskim metodama.

Kada se raspravlja o specifičnosti i osjetljivosti DNK dijagnostičkih metoda, prvo treba odrediti što je u pitanju - određivanje specifične mutacije ili traženje nepoznatog genetskog poremećaja kod pacijenta. U slučaju specifične mutacije, za koju su razvijene pouzdane metode otkrivanja, osjetljivost i specifičnost detekcije su blizu 100%. Da bi se odredila dijagnostička vrijednost ukupnog molekularno genetičkog testa, potrebno je uzeti u obzir osjetljivost detekcije mutacija u kombinaciji s njihovom penetracijom.

Pozitivna dijagnostička vrijednost testa u velikoj je mjeri određena penetracijom mutacija. Na primjer, otkrivanje trisomije na kromosomu 21, ili mutacije specifične za Duchenenovu mišićnu distrofiju ili Huntingtonovu bolest, sugerira da ti pojedinci s vjerojatnošću blizu 100% imaju ili će dalje razvijati odgovarajući klinički sindrom. Međutim, takva visoka pozitivna dijagnostička vrijednost nije tipična za sve genetske testove. Kod mutacija slabe penetracije, na primjer, kod nositelja mutacija hemohromatoze, vjerojatnost razvoja kliničkih manifestacija ne prelazi nekoliko postotaka. U takvim slučajevima otkrivanje defekta samo ukazuje na predispoziciju za razvoj ove bolesti, koja snažno ovisi o prisutnosti dodatnih nasljednih čimbenika i čimbenika okoliša.

Što je genetska struktura ove bolesti jednostavnija i istraživana, to je lakše otkriti mutaciju i to je veća osjetljivost testa. Nažalost, velika većina genetskih bolesti uzrokovana je širokim rasponom mutacija, koje se često nalaze u različitim genima. U kombinaciji s ograničenim mogućnostima modernih molekularnih metoda, to smanjuje osjetljivost molekularnog genetičkog testiranja. Primjerice, trenutno, čak iu najboljim molekularno-genetskim laboratorijima koji rade s bolesnicima s obiteljskom hiperkolesterolemijom, mutacije se mogu otkriti samo kod polovice bolesnika s potvrđenom kliničkom dijagnozom. Drugi primjer je Duchenenova miodistrofija. U ovom slučaju, bolest delecije u genu za distrofin može se otkriti samo u 70% slučajeva, a ostalim pacijentima je potrebna dodatna histološka analiza biopsije mišića. U slučajevima kada test nije u stanju otkriti sve genetske promjene koje dovode do bolesti, njegova negativna prediktivna moć je niska.

U određenim situacijama, negativna prediktivna moć DNA testova može biti vrlo visoka. Riječ je o prenatalnoj i presimptomatskoj dijagnostici u slučajevima kada su poznate patogene mutacije koje su prisutne u roditeljima. U takvoj situaciji visoka točnost molekularnih metoda omogućuje dovoljno pouzdano pokazivanje ne samo prisutnosti, nego i odsutnosti roditeljskih mutacija u fetusa ili djeteta.

Rezimirajući, možemo reći da većina molekularno genetičkih testova ima značajnu pozitivnu prediktivnu moć, što je preporučljivo koristiti u klinici, osobito u slučaju visoke penetracije i patogenosti mutacija. Nasuprot tome, negativna prediktivna moć većine molekularnih testova je mala, osim kada je poznato koje su mutacije u roditeljima.

4.5.3. PRIMJERI KORIŠTENJA DNA DIJAGNOSTIKE U KLINICI

Kao što je poznato, klasična medicinska genetika opisuje monogene visoko penetrantne i klinički ozbiljne bolesti. Učestalost takvih bolesti obično ne prelazi 1 na 5000 stanovnika. Oko tisuću monogenih nasljednih bolesti može se otkriti pomoću DNK analize. Popis testova i laboratorija koji ih provode stalno se ažurira na internetu (http://www.geneclinics.org). Većina DNK dijagnostika sada se koristi u genetskom savjetovanju i prenatalnoj dijagnostici kako bi se spriječilo rađanje djece s patologijom.

Međutim, pored klasičnih monogenskih slučajeva, u klinici se često susreću i nasljedne bolesti koje karakterizira relativno niska penetracija i relativno blagi tijek. Tradicionalno se pripisuju monogenom, međutim, nedavno prikupljeni podaci ukazuju na više oligogene prirode ovih bolesti.

Slijedi detaljna diskusija o nekoliko uobičajenih ljudskih oligogenih bolesti, kao što su hemohromatoza, nasljedna trombofilija, obiteljska hiperkolesterolemija, cistična fibroza i hipertrofična kardiomiopatija. Heterozigotni nositelji mutacija koje dovode do ovih bolesti javljaju se u populaciji s učestalošću od 1 do 500 do 1 od 20 osoba. Zbog visoke populacijske učestalosti bolesti u ovoj skupini, značajna je

ukupni doprinos ljudskoj patologiji, vjerojatno iznad doprinosa rijetkih nasljednih bolesti. Za sve ove bolesti, DNK testiranje omogućuje presimptomatsku dijagnozu, te za hemokromatozu, trombofiliju i hiperkolesterolemiju, te naknadnu profilaksu, farmakološki i promjenom načina života.

To je jedan od najčešćih genetskih poremećaja metabolizma koji se nazivaju kongenitalnim metaboličkim pogreškama.

Klasična triada - dijabetes, ciroza i pigmentacija kože ("brončani dijabetes") opisana je već 1865. godine, a 1935. dokazana je obiteljska priroda ove bolesti. Temelj kliničkih manifestacija GC je biokemijski defekt - prekomjerno nakupljanje željeza u parenhimskim stanicama jetre, gušterače, srca i prednje hipofize. Da biste spriječili razvoj kliničkih manifestacija, možete koristiti vrlo jednostavan i istodobno učinkovit način - preventivnu flebotomiju. Srednji GC fenotip je povišena razina željeza u plazmi i jetri, što se procjenjuje različitim biokemijskim testovima, kao što je zasićenje transferina željezom, koncentracija feritina i sadržaj željeza u jetri.

Kliničke manifestacije GC su vrlo različite. Jedna od najčešćih manifestacija je kronično oštećenje parenhima jetre. Karakteristično je opće ili lokalno pojačavanje pigmentacije kože. 30-60% bolesnika s uznapredovalom bolešću ima dijabetes. U ranim stadijima GC pojavljuju se nespecifični simptomi kao što su letargija, hepatomegalija, artropatija, kardiomiopatija, dijabetes, hiperpigmentacija kože ili hipogonadizam. Kliničke manifestacije ovise o genetskim i vanjskim čimbenicima, kao što su sadržaj željeza u prehrani, darivanje krvi i fiziološki gubitak krvi kod žena tijekom menstruacije.

Godine 1996. identificiran je gen koji je bio odgovoran za najčešći oblik GC, koji se zvao HFE. Ovaj gen kodira transmembranski protein koji se sastoji od kratke citoplazmatske domene, transmembranske regije i tri izvanstanične domene koje interagiraju s P₂-mikroglobulina na površini stanice. HFE protein se veže na površini enterocita do receptora transferina i smanjuje afinitet za prijenos transferina

željeza. U nedostatku funkcionalno aktivnog HFE povećava se vezivanje i naknadna endocitoza transferina, što dovodi do nakupljanja željeza unutar stanice, gdje se pohranjuje kao kompleks s feritinom. Među pacijentima keltskog porijekla s klinički teškim GC, oko 90% su homozigotni za Cis mutaciju₂₈₂-Guma u HFE genu, a većina preostalih ima kombinaciju Cys₂₈₂-Tyr i još jedna mutacija - GiS_os-Asp. Kao rezultat mutacije Cis₂₈₂-Tir ometa formiranje disulfidne veze u jednoj od izvanstaničnih domena HFE proteina, njegova konformacija je poremećena i protein ostaje nakon sinteze u endoplazmatskom retikulumu. Kao rezultat, protein prestaje biti izražen na površini stanice, što dovodi do pojačanog hvatanja željeza, što je nedovoljno za potrebe organizma. U većini bijelaca, učestalost heterozigotnih nositelja Cis alela₂₈₂-Raspon je oko 10%, a za Baske i Irce keltskog podrijetla učestalost ovog polimorfizma može doseći 30%. Za razliku od Europljana, ova se mutacija gotovo nikada ne nalazi u mongoloidima i negroidima. Pretpostavlja se cis mutacija₂₈₂-Guma je nastala prije oko 2000 godina u keltskoj populaciji i proširila se diljem Europe zbog migracije stanovništva, tj. Uzrok visoke učestalosti ove mutacije je učinak osnivača.

Postoje i druge bolesti s kliničkom slikom sličnom klasičnom obiteljskom GC (također klasificiranom kao tip 1 GC), ali različitog podrijetla. Juvenilni GC (tip 2), kao i tip 1 GC, nasljeđuju se autosomno recesivno i uzrokovani su mutacijama u nepoznatom genu. GC tipa 3 također je recesivna bolest i povezan je s mutacijom receptora transferina. GC četvrte i pete vrste dominantno su naslijeđene i uzrokovane su mutacijama u genima ferroportina, koji prenose željezo u crijevima, i feritinom. Svi ovi oblici su vrlo rijetki, a danas njihova definicija nema praktičnu ulogu.

Guma u HFE genu karakterizira visoka penetracija u odnosu na srednji fenotip, tj. Biokemijski znak viška željeza u tijelu. 95% muškaraca starijih od 40 godina koji su homozigotni za ovu mutaciju imaju višak željeza i postoje klinički znakovi i simptomi. Premenopauzalne žene imaju manji rizik zbog gubitka krvi tijekom

menstruacija. Fenotipski učinak GiS mutacije_os-Asp je manje izražen. Fibrozom ili cirozom jetre otkriva se analizom biopsije u 4-25% homozigotnih nosača alela Cis₂₈₂

Strelište Osim toga, Cis alel₂₈₂-Tir predisponira razvoj hepatocelularnog karcinoma. Kod muškaraca s GC i cirozom, relativni rizik od razvoja hepatocelularnog karcinoma je 200 puta veći.

ISPITIVANJE MEDIJA

Prisutnost gore navedenih simptoma je indikacija za genetsko testiranje na GC. Međutim, dijagnoza se postavlja tijekom proširene kliničke slike, kada je prekasno za prevenciju primarnog defekta. U tom smislu, mnogi istraživači zagovaraju potrebu za skriningom populacije na prisutnost GC. Ova bolest zadovoljava mnoge zahtjeve za bolesti koje su podvrgnute probiru, tj. često se pojavljuje, ima latentnu fazu koja prethodi kliničkim manifestacijama, lako se dijagnosticira biokemijskim i genetskim metodama i može se spriječiti pomoću učinkovitog i jeftinog liječenja.

Međutim, za sada se masovni pregled smatra preuranjenim zbog dvosmislenosti, koje se uglavnom odnose na penetraciju GC-a. Svakako je poželjno testirati rodbinu bolesnika s GC, koji trebaju mjeriti razinu saturacije transferina željezom, sadržaj feritina i biokemijskih biljega disfunkcije jetre, te utvrditi prisutnost mutacija u HFE genu po položaju 282 i 63.

S tehničke točke gledišta, otkrivanje tih mutacija nije teško. Uobičajeno se koriste restrikcijska analiza ili različiti oblici amplifikacije ili hibridizacije alel-specifičnih.

4.5.3.2. Nasljedna trombofilija

Trombofilija je tendencija da se razvije tromboza povezana s kongenitalnim i stečenim poremećajima zgrušavanja krvi i fibrinolizom. Trombofilija se najčešće javlja kao venska tromboza i tromboembolija, koja se javljaju s učestalošću od oko 1 na 1000 stanovnika godišnje.

Postoje obiteljski oblici trombofilije, opisani još u pedesetim godinama prošlog stoljeća. Prvi identificirani uzroci nasljedne trombofilije (NTF) bili su manjak antitrombina III,

Protein C i njegov proteinski kofaktor S. Kasnije su identificirana još dva oblika NTF-a - mutacija faktora V koagulacije, koja uzrokuje otpornost faktora V na aktivirani protein C, i mutaciju u protrombinskom genu G20210A, što povećava razinu protrombina u plazmi. Osim toga, umjerena hiperhomocisteinemija, često povezana s raširenim polimorfizmom u genu MTHFR, također je faktor rizika za vensku trombozu.

TROMBOEMBOLSKA KOMPLIKACIJA Težina kliničkih manifestacija NTF-a uvelike varira. Često se odvijaju u vrlo blagom obliku i njihova se prisutnost može odrediti samo laboratorijskim metodama. Međutim, u mnogim slučajevima nositelji mutacija razvijaju duboku vensku trombozu donjih ekstremiteta, plućnu tromboemboliju, površinski tromboflebitis, kao i venske tromboze druge lokalizacije. Ovi nasljedni defekti obično nisu povezani s rizikom začepljenja arterija. NTF predisponiraju razvoj tromboze u mladoj dobi: do 40% bolesnika mlađih od 45 godina s neizazovanom dubokom venskom trombozom ima jedan od oblika NTF-a. Kod starijih bolesnika ili u prisutnosti izazivačkih čimbenika NTF opažen u 30% slučajeva tromboze. U bolesnika s kombinacijom nasljednih defekata, rizik od tromboembolijskih komplikacija se dalje povećava.

Nasljedna manjkavost antitrombina III i proteina C i S javlja se ukupno manje od 1% populacije, ali u bolesnika s venskom tromboembolijom (VTE) nalazi se u gotovo 10% slučajeva. Rizik od VTE kod takvih bolesnika je 5-8 puta veći nego u općoj populaciji. Razlozi nedostatka ovih prirodnih antikoagulanata mogu biti smanjenje njihove sinteze ili (češće) smanjenje funkcionalne aktivnosti proteina uz održavanje normalne razine. Nedostaci sinteze ili funkcioniranja proteina uzrokovani su stotinama različitih mutacija u tim genima.

Nasljedna otpornost na aktivirani protein C je najčešći uzrok NTF-a. U više od 95% slučajeva, otpornost je uzrokovana mutantnom mutacijom u genu Factor V, nazvanoj Leydenovoj, u kojoj je na položaju 506 arginin zamijenjen glutaminom. Ovaj aminokiselinski ostatak obično uzrokuje proteolitičko cijepanje faktora V aktiviranim proteinom C. Protein C je prirodni antikoagulant koji se aktivira trombin-trombomodulinom

kompleks na endotelnim stanicama i uništava faktore Vi viii, što dovodi do zaustavljanja stvaranja tromba. Ovaj proces je značajno ubrzan u prisutnosti proteina S, koji djeluje kao kofaktor proteina C. Ako postoji supstitucija amino kiseline u faktoru Va Arg₅₀₆-Gln aktivirani protein C ne može ga slomiti, što dovodi do očuvanja aktivnosti faktora Va i povećanog stvaranja tromba (sl. 4.17).

Leidenova mutacija pojavljuje se gotovo isključivo među bijelcima, u kojima je oko 5% populacije nositelj. Međutim, zbog visoke učestalosti ove genetske forme u općoj populaciji, treba je uputiti na polimorfizam

Sl. 4.17. Otpornost na aktivirani protein C uzrokovan Leidenovom mutacijom.

u literaturi je ime mutacije fiksirano na njega. Među bolesnicima s VTE, učestalost ove mutacije je veća i iznosi oko 20%. Rizik VTE kod nositelja Leidenove mutacije ovisi o dozi gena: kod heterozigota povećava se 2-7 puta, au homozigotima 40-80 puta. Ukupna vjerojatnost nastanka tromboembolije tijekom života nositelja ove mutacije je 30%.

Polimorfni alel G20210A u 3'-netranslatiranoj regiji protrombinskog gena u općoj populaciji javlja se s učestalošću od 2%, ali kod pacijenata s VTE, udio nosača polimorfizma raste na 7%. Dakle, prisutnost polimorfizma G20210A u protrombinskom genu povećava rizik od VTE za oko 3 puta. Patološki učinak ovog polimorfizma je povećanje aktivnosti protrombina u plazmi. Razina protrombina u homozigotima AA je 1,5 puta viša od homozigota u normalnom alelu GG, što pridonosi trombozi. Očigledno, mutacija G → A odnosi se na tip mutacija sa stjecanjem funkcije, jer povećava učinkovitost obrade 3'-kraja mRNA, što dovodi do akumulacije mRNA i povećanja sinteze protrombinskog proteina.

Još jedan predisponirajući čimbenik za trombozu je povećana razina homocisteina, aminokiseline nastale tijekom metabolizma metionina. Umjereno povećanje homocisteina povećava rizik od arterijske i venske tromboze. Razlog povećanja može biti ili abnormalna prehrana (nedostatak piridoksina, kobalamina, folata) ili genetski čimbenici, kao što je Al polimorfizam.₆₇₇

Osovina u genu metilenetetrahidrofolat reduktaze - enzim koji igra važnu ulogu u određivanju razine homocisteina u plazmi. Aktivnost ove varijante enzima je samo oko 1/3 normale. Oko 10% bijelaca su heterozigotni nositelji ovog polimorfizma. Učestalost VTE u izoliranim nosiocima ovog polimorfizma nije različita od normalne, ali brojni podaci pokazuju da polimorfizam C677T doprinosi manifestaciji drugih NTF-a.

BEREMENALNOST I OBJEKTIVNA PATOLOGIJA Tijekom trudnoće povećava se razina faktora koagulacije ovisnih o vitaminu K, smanjuje se sadržaj proteina S i inhibira fibrinoliza. Te su promjene fiziološki izvedive jer su usmjerene na smanjenje gubitka krvi tijekom poroda, ali i povećavaju vjerojatnost VTE-a tijekom trudnoće (2,5 puta), a posebno u postporođajnom razdoblju (20 puta).

U prisutnosti NTF-a, ta je vjerojatnost još veća i može doseći 100-puta homozigot za Leidenovu mutaciju faktora V. Većina (do 60%) žena s VTE-om koje su se razvile tijekom trudnoće imale su Leidenovu mutaciju.

Osim venske tromboembolije, NTF doprinose razvoju opstetričke patologije. Kršenje cjelokupne placentne cirkulacije maternice zbog tromboze može dovesti do raznih komplikacija u trudnoći, kao što su pobačaj, mrtvorođenost, abrupcija posteljice, preeklampsija i intrauterini zastoj rasta. Brojne studije pokazale su povećanu učestalost NTF-a u bolesnika s tim komplikacijama. Također postoje dokazi da prisutnost mutacije ne samo kod majke, već i kod fetusa može dodatno povećati rizik od tromboze i infarkta posteljice, što dovodi do gubitka fetusa. Relativni rizik komplikacija u trudnoći kod heterozigotnih nositelja Leidenove mutacije ili polimorfizma protrombinskog gena G20210A prema različitim istraživanjima povećao se u prosjeku 2-3 puta.

Prihvaćanje oralnih kontraceptiva također doprinosi razvoju VTE. Taj se učinak povećava kod žena s NTF-om. Rizik razvoja VTE kod nositelja Leidenove mutacije uzimanje oralnih kontraceptiva, prema različitim procjenama, povećava se za 20-65 puta. U prisutnosti protrombina G20210A, rizik od VTE je nešto manji, ali također značajno premašuje normalnu vrijednost. Na temelju ovih opažanja, preporuča se da se ne koriste oralni kontraceptivi za žene s nedostatkom prirodnih antikoagulanata, homozigoti za Leydenovu mutaciju i uz prisutnost kombiniranih defekata.

Hormonska nadomjesna terapija nakon menopauze je još jedno jatrogeno stanje s 2-4-strukim povećanjem rizika od VTE. U prisutnosti Leidenove mutacije, relativni rizik može se povećati 15 puta, a učestalost ponovljene tromboze također se povećava. U tom smislu, nositelji NTF-a koji su imali epizode VTE, preporuča se da ne koriste hormonsku nadomjesnu terapiju.

INDIKACIJE ZA GENETIČKU ANALIZU Analiza Leidenove mutacije i protrombinskog polimorfizma G20210A, kao i određivanje deficita antitrombina i proteina C i S, je učinkovita metoda za identifikaciju osoba s povećanim rizikom od trombotičkih stanja. Otkrivanje tih mutacija omogućuje nosiocima provođenje profilaktičke antikoagulantne terapije.

Zbog niske apsolutne učestalosti VTE, masovno pretraživanje populacije za prisutnost NTF nije opravdano. Smatra se prikladnijim ispitati sljedeće skupine pacijenata za prisutnost NTF-a:

• osobe s VTE, bez obzira na dob i težinu manifestacija;

• žene s jednim ili više spontanih pobačaja u kasnoj fazi ili s dva ili više pobačaja;

• trudnice s intrauterinim zastojem rasta ili abrupcijom posteljice;

• rođaci prvog stupnja srodnosti pacijenta s NTF-om u povijesti;

• žene s obiteljskom anamnezom NTF-a prije uporabe oralnih kontraceptiva, nadomjesne hormonske terapije ili trudnoće.

DIJAGNOSTIČKI TESTOVI Testovi visokog prioriteta za prisutnost NTF-a uključuju sljedeće:

• određivanje aktivnosti antitrombina (amidolitička metoda);

• određivanje aktivnosti C proteina (koagulometrijska ili amidolitička metoda);

• određivanje koncentracije proteina S (frakcije ukupnog i slobodnog antigena);

• koagulometrijsko određivanje otpornosti na aktivirani protein C;

• određivanje Leidenove mutacije faktora V;

• određivanje protrombinskog polimorfizma G20210A;

• određivanje razine homocisteina u plazmi.

Kao što se može vidjeti iz gornjeg popisa, nedostatak antitrombina i proteina C i S određen je funkcionalnim metodama. To je zbog činjenice da su ovi nedostaci uzrokovani velikim brojem mutacija i da ih je potrebno identificirati zahtijevajući velike napore i troškove, dok su funkcionalne analize jednostavne i pouzdane.

Analiza Leidenove mutacije i protrombinskog polimorfizma je jednostavna i dobro nadopunjuje funkcionalna ispitivanja. Očigledno, analiza polimorfizma C677T u genu metilen tetragid rofolatreduktaze nema posebnu dijagnostičku vrijednost i treba je koristiti u kombinaciji s biokemijskim određivanjem koncentracije homocisteina u plazmi. Primjena ovog skupa testova omogućuje otkrivanje nasljednog defekta faktora zgrušavanja ili povećanje homocisteina u približno 40% bolesnika s VTE.

Najpouzdanija metoda za identifikaciju Leidenove mutacije i protrombina G20210A je restrikcijska analiza, ali se također široko koriste alele-specifični PCR i hibridizacija.

4.5.3.3. Obiteljska hiperkolesterolemija

Obiteljska hiperkolesterolemija (FHC) je očito najčešća autosomno dominantna bolest ljudi. Učestalost FHD u većini populacija je 1 na 500. U populaciji s efektom osnivača, heterozigotni oblici su mnogo češći: 1 od 70 u afrikanerima u Južnoj Africi i 1 od 200 u Kanađanima francuskog podrijetla. Iz istog razloga, učestalost FHD-ova u Fincima, Druzama i Libanoncima je povećana.

Nisu svi slučajevi FHC klinički dijagnosticirani. Primjerice, u Rusiji je manje od 1% bolesnika s FHCS-om postavilo kliničku dijagnozu, a najučinkovitija dijagnoza (preko 40% identificiranih nositelja) provedena je na Islandu zbog male veličine populacije s izraženim efektom osnivača i malom varijabilnošću mutabilnosti.

Glavne dijagnostičke značajke SGHS-a su povišeni kolesterol u krvi, prisustvo ksantoma tetiva u bolesnika ili rodbina prvog stupnja, te dominantni uzorak nasljeđivanja povišenog kolesterola ili ishemijske bolesti srca.

Klinički, SGHS se manifestira povećanim rizikom od ateroskleroze i njezinih komplikacija. Mehanizmi koji povezuju povećanje kolesterola s razvojem koronarne arterijske bolesti nisu u potpunosti shvaćeni. Pretpostavlja se da visoka razina LDL-a obogaćena kolesterolom doprinosi njihovom prodiranju u stijenku krvnih žila, gdje oksidiraju i aktiviraju lanac staničnih reakcija koje dovode do akumulacije lipida i lokalne reorganizacije stijenke krvnih žila, što rezultira aterosklerotskim plakom. U slučaju FHC-a, rizik smrti od infarkta miokarda u mladoj dobi - do 40 godina - povećava se 100 puta. Kod ne-liječenih muškaraca s FHD-om u dobi od 60 godina, vjerojatnost CHD je oko 75%. Prema nekim procjenama, samo polovica muškaraca sa SGHS-om živi do 60 godina. Prosječna dob početka IHD-a je 40-45 godina za muškarce, a za žene 10 godina. Dakle, koronarna arterijska bolest u bolesnika s FHD-om razvija se 10–20 godina ranije od prosjeka populacije.

Statini i drugi lijekovi za snižavanje lipida učinkovito se koriste za smanjenje razine lipoproteina u plazmi u SHHS.

Najteži pacijenti (u pravilu, to su homozigotni slučajevi) tretiraju se uklanjanjem viška LDL izmjenom plazme. Ponekad se koristi transplantacija jetre.

BIOKEMIJSKI I GENETIČKI MEHANIZMI

Kada se SGHS kolesterol poveća zbog povećanja LDL u plazmi. Ovaj metabolički poremećaj povezan je sa smanjenjem klirensa LDL-a u jetri kao rezultat smanjenja ekspresije ili aktivnosti staničnih receptora koji posreduju u prihvaćanju LDL čestica (LDL receptora). Aktivnost LDL receptora u FHCS smanjuje se na svim stanicama koje eksprimiraju ovaj receptor, međutim, funkcionalne posljedice uglavnom su povezane s defektom receptora u jetri, budući da narušavanje pretvorbe kolesterola u žučne kiseline dovodi do smanjenja njegovog izlučivanja kroz crijeva. Slične biokemijske abnormalnosti uočene su s mutacijskom promjenom u proteinu apoB-100, koji je ligand za LDL receptor. Kao rezultat ove mutacije, LDL čestice se više ne prepoznaju od strane LDL receptora i akumuliraju se u plazmi.

Gen receptora LDL sadrži 18 eksona koji kodiraju šest funkcionalnih domena ovog proteina: signalni peptid, domenu za vezivanje liganda, domenu homolognu prethodniku epidermalnog faktora rasta, O-glikozilacijsko mjesto, transmembransku i citoplazmatsku domenu. Sve poznate mutacije u LDLR genu prikupljene su u UMD-LDLR bazi podataka, koja je dostupna putem Interneta. Broj ulazaka u njega premašio je 800 i nastavlja rasti. Prema bazi podataka UMD-LDLR, jednostruke nukleotidne supstitucije čine 90% svih mutacija u LDLR genu, većina njih su mutantne i besmislene mutacije. Preostalih 10% su uglavnom makrotransformacije uzrokovane nejednakom rekombinacijom s više od 30 kopija Alu sekvenci prisutnih u ovom genu. U promotoru je pronađeno manje od 10 mutacija.

Iako je SGHS monogena bolest, fenotipska ekspresija, naime ozbiljnost IHD, uvelike varira čak i među pacijentima koji nose iste mutacije. Neki pacijenti žive do 80 godina ili stariji, dok drugi umiru od srčanog udara na 20 godina. Čimbenici koji utječu na kliničke manifestacije mogu biti vanjski, metabolički i genetski.

Od čimbenika okoliša, pušenje i prehrambene navike igraju posebnu ulogu. Pušenje je jedan od najjačih prediktora smrtnosti od koronarne bolesti srca u bolesnika s FHD. Uloga prehrane u razvoju

FHCS je dokazan usporedbom bolesnika kineskog podrijetla koji žive u Kanadi s nositeljima istih mutacija, ali koji žive u Kini.

Kanadski Kinezi imaju LDL kolesterol 70% veći nego u Kini. Osim toga, 6 od 16 heterozigota koji su živjeli u Kanadi imali su ksantome, a 4 su imali CHD. Niti jedan od 18 ispitanika koji su živjeli u Kini nije imao ksantom ili ishemičnu bolest srca. Očigledno, takve razlike u kliničkim manifestacijama povezane su s različitom konzumacijom nezasićenih masti. Ovaj primjer jasno ilustrira modificirajući učinak vanjskih čimbenika, kao što je dijeta, na fenotip heterozigotne SHKS.

Tijek bolesti jako ovisi o vrsti mutacije koja uzrokuje hiperlipidemiju. Najjača hiperkolesterolemija razvija se u prisutnosti nultih mutacija, što dovodi do potpunog izostanka aktivnog receptora, dok mutacije s očuvanjem djelomične sinteze ili aktivnosti LDL-receptora obično uzrokuju blažu bolest.

Postoji niz biokemijskih parametara koji modificiraju razvoj koronarne arterijske bolesti u bolesnika s SHHS-om. Ti metabolički čimbenici su: HDL kolesterol, C-reaktivni protein i fibrinogen. Neki od tih čimbenika, kao što su HDL-kolesterol i lipoprotein Lp (a), imaju izraženu genetsku osnovu. Drugi dokazani ili sumnjivi genetski čimbenici uključuju mutacije u lipoprotein lipaznom genu - apolipoprotein E izoformama, primjenjivim varijantama proteina kolesterolnog estera, polimorfizmu paraoksonaze (polimorfizam lipidnog peroksida enzima), određenom genotipu metilen tetrahidrofolat reduktaze (povezan s povećanom razinom homocisteina). sustava, kao i proteina koji nose mikrosomalni triglicerid, a koji utječu na sekreciju VLDL.

Dakle, genetski, mutacije LDL receptora su glavni čimbenik koji određuje razvoj FHC. Doprinos drugih gena je neporeciv, međutim, zbog relativno malog broja pacijenata s identificiranim mutacijama LDL receptora, potrebna su daljnja istraživanja modifikacijskih gena. U idealnom slučaju, određivanje pacijentovog genotipa pomoću ovih dodatnih gena omogućit će određivanje stupnja rizika od bolesti koronarnih arterija i drugih komplikacija kod nositelja određene mutacije u LDL receptoru ili genu apoB-100.

Pojedinačna razina kolesterola podložna je prirodnim promjenama, tako da se ne može izvesti zaključak na temelju jednog mjerenja kolesterola

o dostupnosti SGHS-a. Osim toga, razina kolesterola ovisi o dobi, spolu i varira u različitim populacijama. Razina kolesterola u FHCS često prelazi prosječnu razinu u općoj populaciji, stoga je nemoguće napraviti dijagnozu samo na temelju rezultata mjerenja kolesterola u plazmi u nekim slučajevima.

Trenutno je detekcija mutacija u LDL receptoru ili genu apoB-100 uobičajeni kriterij u dijagnostici FHC. Mutacija na 3500. nukleotida u genu apoB-100 (obiteljski defekt apoB) najčešći je uzrok FHC-a u većini populacija. U Europi i zemljama u kojima žive ljudi iz Europe (Australija, SAD, Kanada i Novi Zeland), ova mutacija je uzrokovana u 3-5% bolesnika s FHCS-om. U zemljama sa složenom genetskom strukturom bolesti, mutacije se mogu naći u 30-50% bolesnika s kliničkom dijagnozom SGHS. To je posljedica neadekvatne osjetljivosti metoda probira i pogrešne dijagnoze utvrđene na temelju razine kolesterola i kliničkih manifestacija. Također postoji mogućnost postojanja dodatnih gena, uz LDLR i APOB, mutacije u kojima su popraćene sličnom kliničkom slikom.

U velikom broju populacija, DNA dijagnostika SGHS-a značajno je pojednostavljena zbog prisutnosti ograničenog broja mutiranih alela.

Međutim, u većini genetski otvorenih populacija, u koje spada i Rusija, nijedna mutacija u genu LDL receptora nije pronađena češće nego u 1% bolesnika s FHC-om i obično mnogo rjeđe. U tom smislu, metode skrininga za pretraživanje mutacija, kao što je određivanje polimorfizma konformacije jednolančane DNA, nakon čega slijedi potvrda sekvencioniranjem, igraju važnu ulogu u DNA dijagnostici FHCS.

4.5.3.4. Cistična fibroza

Cistična fibroza (CF) je jedna od najčešćih i istodobno teških autosomno recesivnih bolesti kod ljudi. Među Europljanima, frekvencija nosioca je oko

1 do 50, a klinički oblici javljaju se ovisno o regiji s učestalošću od 1 do 2-3 tisuće ljudi.

CF je dobila ime po prirodi mikroskopskih promjena koje su uočene u gušterači kod takvih bolesnika. Bolest također pogađa pluća, jetru, tanko crijevo i muški reproduktivni sustav. Ključnu ulogu u patogenezi ima prekomjerno izlučivanje sluzi epitelom tih organa, što dovodi do opstrukcije bronha ili izlučnih kanala jetre i gušterače. Unatoč značajnom poboljšanju simptomatskog liječenja, bolesnici s CF obično ne žive dulje od 20-30 godina. Glavni uzrok smrti je oštećenje pluća uzrokovano začepljenjem bronha, što stvara povoljno okruženje za sekundarne infekcije. Kronične infekcije i upalna reakcija dovode do fibroze plućnog tkiva, što u kombinaciji s opstrukcijom respiratornog trakta može uzrokovati respiratornu insuficijenciju. U 65% bolesnika, začepljenje kanala gušterače sprječava izlučivanje probavnih enzima u crijevo, što dovodi do poremećaja probave. Slično tome, kršenje izlučivanja žuči u jetri, promatrana u 5% bolesnika. Osim ovih manifestacija, 10% novorođenčadi razvija opstrukciju tankog crijeva, što zahtijeva kiruršku intervenciju. Osim toga, 95% muškaraca s CF ima neplodnost. Karakteristično svojstvo CF-a, koje se naširoko koristi za dijagnozu, je povećani salinitet znoja povezan s oslabljenom reapsorpcijom C1

epitel koji oblaže kanale znojnih žlijezda.

KF je uzrokovan mutacijama proteina kodiranog s CFTR genom (transmembranski regulator vodljivosti cistične fibroze). Ovaj gen se sastoji od 27 egzona i kodira protein molekulske mase od 168 kDa, koji sadrži dvije transmembranske domene, dvije unutarstanične domene za vezanje nukleotida i regulatornu domenu. Ovaj protein je kanal za C1-ione. Ovaj kanal se aktivira cAMP-ovisnom proteinskom kinazom, koja fosforilira regulatornu domenu. Izlaz C1 - iz stanice započinje lanac reakcija koje dovode do zatvaranja Na + kanala i pojačavaju proizvodnju mukozne sekrecije.

Najčešći uzrok CF je delecija tri nukleotida u 508. kodonu, što dovodi do gubitka fenilalanina. Učestalost ove mutacije u bolesnika s CF varira od 50% u Srednjoj Europi do gotovo 90% na sjeveru. Kao rezultat ove mutacije, normalna obrada proteina je poremećena i, nakon sinteze, ona se ne transportira u plazmatsku membranu, nego se zadržava u endoplazmatskom retikulumu i degradira. Međutim, postoji veliki broj

druge mutacije koje oštećuju ovaj protein; njihov broj se približava 1000. Ove rijetke mutacije mogu imati različit učinak na kloridni kanal, na primjer, djelomično ili potpuno smanjiti sintezu proteina, poremetiti njegov unutarstanični transport ili smanjiti funkcionalnu aktivnost kanala. Neke od tih mutacija uzrokuju samo djelomično smanjenje sinteze ili aktivnosti kanala, što može dovesti do različitih funkcionalnih manifestacija. U onim slučajevima kada je sačuvano manje od 3% aktivnosti, razvija se teška CF, praćena oštećenjem gušterače. Ako uštedite 3-8% aktivnosti utječe na pluća, a gušterača je normalno. Ako je aktivnost kanala C1 8-12%, uočeni su blagi oblici, kao što je azoospermija kod muškaraca. Međutim, takav jednostavan odnos se ne poštuje uvijek. Predvidite tijek bolesti moguće je samo ako postoji homozigotnost za deleciju fenilalanin-508 ili istodobnu prisutnost te delecije i mutacije G551D. U prisutnosti ovih mutacija, bolest se nastavlja u klasičnom teškom obliku s lezijom gušterače. U većini drugih slučajeva teško je predvidjeti odnos između vrste mutacije i manifestacije bolesti. Sve je više dokaza da je CF oligogena bolest, a njezine fenotipske manifestacije ne ovise samo o prirodi mutacije, već io skupu modificiranih gena prisutnih u pacijentu.

CF se gotovo uvijek može dijagnosticirati u prenatalnoj fazi analizom DNK iz korionskih resica, bilo izravnim određivanjem mutacija, ili uporabom analize veza pomoću polimorfnih intragenih markera u slučajevima kada su mutacije u bolesnom djetetu nepoznate. Trenutno se razmatra pitanje pregleda populacije na prisutnost CF-a. Akumulirane informacije o genetskoj strukturi CF-a omogućile su nam da odaberemo 30 mutacija iz gotovo 1000 poznatih, što, međutim, objašnjava 90% slučajeva CF-a u različitim regijama Europe i SAD-a. Tehnički, DNK dijagnostika CF-ova je prilično dobro razvijena, a za njegovu provedbu izrađuje se niz komercijalnih kompleta.

4.5.3.5. Hipertrofična kardiomiopatija

Hipertrofična kardiomiopatija (HCM) jedna je od najčešćih ljudskih bolesti s izraženom genetskom predispozicijom. Pojavljuje se s učestalošću od 1 do 500, što je značajno više od učestalosti drugog oblika kardiomiopatije u obitelji - proširenog (1 na 2500). HCM je naslijeđen

na autosomno dominantnom tipu i karakterizira ih penetracija do 75%. Klinički se bolest manifestira u obliku lijeve i / ili desne ventrikularne hipertrofije i povećanja atrijalne veličine. Hipertrofija je obično asimetrična i utječe na interventrikularni septum. Histološki, hipertrofija i nepravilni raspored kardiomiocita, kao i intersticijska fibroza, opaženi su u srčanom mišiću. Bolest dovodi do aritmija i iznenadne smrti, kao i do zatajenja srca.

Uzrok bolesti na molekularnoj razini je disfunkcija proteina koji sačinjavaju sarkomere, tako da se hcmp ponekad naziva sarcomereova bolest. Hipertrofija je kompenzacijski miokardni odgovor na smanjenje kontraktilnosti. Trenutno je identificirano 11 gena, mutacije koje dovode do HCM (Tablica 4.11).

Mutacije sarkomernih proteina imaju različit učinak na kontraktilnu funkciju kardiomiocita. Kao rezultat, misenske mutacije često tvore stabilne, ali neaktivne proteine, koji se ubacuju u sarkomere i ometaju njegovu funkciju, tj. imaju dominantan negativan učinak. Nasuprot tome, mutacije

Tablica 4.11. Mutacije koje dovode do hipertrofične kardiomiopatije

s pomakom okvira, rezultiraju stvaranjem neaktivnih skraćenih proteina, koji su podložni ubrzanoj degradaciji. U oba slučaja smanjuje se kontraktilna aktivnost i razvija se kompenzacijska hipertrofična reakcija.

Tip mutacije može utjecati na ozbiljnost bolesti. Na primjer, visok rizik od iznenadne srčane smrti povezan je s mutacijama u genu MYH7 Arg_4oz-Gln, Arg_45z-Cis i arg_72z-Gli. Nasuprot tome, Gly mutacija_25b-Glu, Val₆₀₆-Met i Lei₉₀₈- Osovina nije povezana s povećanim rizikom od aritmija. Mutacije u genu MYBPC3 obično su povezane s blagom hipertrofijom kod mladih bolesnika, kasnim početkom bolesti i relativno povoljnom prognozom. Dakle, poznavanje vrste mutacije ne samo da potvrđuje dijagnozu hcmp, nego u nekim slučajevima pomaže u određivanju prognoze.

Zbog značajne genetske heterogenosti, molekularna dijagnostika hcmp-a predstavlja određenu složenost. Zbog raznolikosti mutacija, metode pretraživanja kao što su analiza polimorfizma konformacije jednolančane DNA, elektroforeza u gradijentu denaturanta, te također denaturirajuća HPLC se uglavnom koriste za traženje ove bolesti. Potraga za mutacijama provodi se uglavnom u genu β-miozina teškog lanca, kao iu genima srčanog troponina T i srčanog miozin-vezujućeg proteina C.

Biokemijska dijagnostika bolesti jetre. Kratke informacije o strukturi jetre.

Biokemijska dijagnostika bolesti

Dekodiranje biokemijske analize krvi

Što pokazuje biokemijski test krvi?

Koje su indikacije za biokemijsku analizu krvi?

Kako uzeti test krvi za biokemiju?

Norme biokemijske analize krvi (tablica)

Kako dešifrirati biokemijsku analizu?

Ukupni protein

bilirubin

enzimi

Mokraćna kiselina

Koliko je biokemijski test krvi?

Biokemija i patobiokemija jetre. Biokemijska dijagnoza bolesti jetre

Biokemijska dijagnostika bolesti

POGLAVLJE 4 BIOKEMIJSKA DIJAGNOSTIKA PATOLOŠKIH PROCESA I HEREDITARNIH BOLESTI

Pročitajte O Čišćenju Jetre

Popularne Kategorije

Cista Jetre

Rak Jetre